ICS 07.100 C 04 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 25632016 甲型 H1N1流感病毒核酸检测 Real-time PCR法 Real-time PCR method for the detection of H1N1 Influenza virus nucleic acid 2016-12-09发布 2017-03-01实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 25632016 I 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：柳鸿敏、李静、吴东林、臧希卉。DB22/T 25632016 1 甲型H1N1 流感病毒核酸检测 Real-time PCR 法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了甲型H1N1流感病毒核酸检测 Real-time PCR法。本标准适用于甲型H1N1流感病毒核酸进行检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 WS 285-2008 流行性感冒诊断标准 3 试剂与材料 3.1 试剂 3.1.1 水：无菌 RNase Free Water 3.1.2 RNA 提取试剂：RNA 提取试剂盒 3.1.3 一步法反应试剂盒 3.1.4 病毒采样液：内带拭子 3.2 阳性对照和阴性对照 3.2.1 阳性对照：甲型 H1N1 流感病毒毒株提取的核酸，且稀释至 Ct 值在 2030 之间 3.2.2 阴性对照：无菌 RNase Free Water 3.3 引物及探针 3.3.1 流感病毒 A型特异性引物及探针 a)FluA-Forward：5-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 b)FluA-Reverse：5-GGG CAT TYT GGA CAA AKC GTC TAC G-3 c)FluA-probe：FAM 5-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-3BHQ1 3.3.2 甲型 H1N1 流感病毒特异性引物及探针 DB22/T 25632016 2 a)SWH1-Forward：5-GGG TAG CCC CAT TGC AT-3 b)SWH1-Reverse：5-AGA GTG ATT CAC ACT CTG GAT TTC-3 c)SWH1-Probe：FAM 5-TGG GTA AAT GTA ACA TTG CTG GCT GG-3 BHQ1 4 仪器和设备 4.1 漩涡振荡器 4.2 Real-time PCR 仪：配相应的反应管 4.3 高速离心机：8000 rpm12 000 rpm 4.4 冷藏冰箱：2 8 4.5 冷冻冰箱：-20 4.6 生物安全柜：CLASS-型 4.7 微量移液器：10 L，100 L，200 L，1000 L 5 试验步骤 5.1 标本 5.1.1 鼻拭子 将拭子（3.1.4）平行于上颚插入鼻孔，旋转，保持数秒，待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。将拭子头浸入病毒采样液（3.1.4）中，弃去拭子尾部，待检。5.1.2 咽拭子 用拭子（3.1.4）适度用力擦拭双侧扁桃体及咽后壁后，将拭子头浸入病毒采样液（3.1.4）中，弃去拭子尾部，待检。5.2 病毒的提取 将上述标本用漩涡振荡器（4.1）充分混匀后，取0.2 mL的病毒采样液置于无菌管中，按照RNA提取试剂盒（3.1.2）的要求提取甲型H1N1流感病毒核酸。提取后的病毒核酸放置2 8 冰箱（4.4）中，如不能及时检测，放置-20 冰箱（4.5）中冷冻保存。5.3 Real-time PCR 反应 5.3.1 引物和探针配制 引物配制：新合成的引物开盖前用高速离心机（4.3）短暂离心15 s。用水（3.1.1）溶解，加水量为10引物的nmol数，充分混匀，此时引物浓度为100 mol/L。将100 mol/L的引物2.5倍稀释，此时浓度为40 mol/L。探针配制：新合成的探针开盖前用高速离心机（4.3）短暂离心15 s。用水（3.1.1）溶解，加水量为10引物的nmol数，充分混匀，此时浓度为100 mol/L。将100 mol/L的探针5倍稀释，此时浓度为20 mol/L。5.3.2 反应体系配制 DB22/T 25632016 3 25 L反应体系：2RT-PCR Buffer 12.5 L，25RT-PCR Enzyme Mix 1 L，40 mol/L的上、下游引物各0.5 L，20 mol/L的探针0.5 L，RNA模板5 L，用水（3.1.1）补足至25 L。设置阳性对照、阴性对照、空白对照和试剂对照。5.3.3 Real-time PCR 反应条件 将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入Real-time PCR仪（4.2）进行扩增，反应条件如下：45 逆转录10 min；95 预变性10 min；95 变性15 s，60 退火45 s，40个循环。在60 退火时收集荧光信号。6 结果判读 6.1 结果判定 流感病毒A型核酸与甲型H1N1流感病毒核酸检测均为阳性，则判断为标本阳性。如只有流感病毒A型核酸检测为阳性，甲型H1N1流感病毒核酸检测为阴性，则判断为甲型H1N1流感病毒核酸检测阴性，建议做流感病毒A型的其他型别检测。如流感病毒A型核酸检测为阴性，甲型H1N1流感病毒核酸检测为阳性，则考虑实验检测过程中有甲型H1N1流感病毒核酸污染，建议重新进行试验。阴性对照反应得到的荧光曲线不应超过阈值线，应无Ct值或为Ct值为零。如果阴性对照出现Ct值，则说明实验过程受到污染，此次检测结果无效，应该严格按照操作程序重复实验。阳性对照的检测结果应为阳性，且Ct值在2030之间。如果阳性对照检测结果未达到要求，则需严格按照操作程序重复试验。当所有对照成立，检测标本在35个循环内出现荧光信号，且呈现典型S扩增曲线，则判断为甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性；若Ct值在3540之间，应重复实验进行确认，如Ct值还在3540之间，可判断为甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性；若无Ct值或Ct值为零，则判断为甲型H1N1流感病毒核酸检测阴性。6.2 结果表述 如判定结果为阳性，则结果表述应为“甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性”；如判定结果为阴性，则结果表述应为“甲型H1N1流感病毒核酸检测阴性”。7 废弃物处理及防治污染的措施 7.1 废弃物处置应按照 GB 19489-2008 的有关规定执行。7.2 为了保护实验室人员安全，应由具备资格的工作人员进行检测。7.3 检测过程中防止污染的措施见 WS/T 230-2002 中的相关规定。_