ICS 67.060 B 22 DB13 河北省地方标准 DB13/T 2598 2017 花生品种 真实性与 纯度鉴定SSR 法 2017-11-22 发布 2017-12-22 实施 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB13/T 2598 2017 I 前 言 GB/T 1.1-2009 DB13/T 2598 2017 1 花生品种 真实性 与纯度鉴 定 SSR 法 1 范围 SSR SSR 2 规范性 引用 文件 GB/T 3543.2-1995 GB/T 3543.4-1995 GB/T 6682-2008 3 术语和 定义 3.1 品种真 实性（Varietal Genuineness）()3.2 品种纯 度（Varietal Purity）3.3 简单重 复序 列 SSR（Simple Sequence Repeat）2 6 注：SSR 3.4 聚合酶 链式 反应 PCR（Polymerase Chain Reaction）DNA 注：DNA DNA DNA DNA dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate DNA DNA DNA DB13/T 2598 2017 2 3.5 引物 Primer DNA 3-OH DNA DNA 3.6 核心引 物 Core Primer SSR 3.7 标准样 品 Standard Sample 4 原理 SSR SSR SSR PCR 5 试剂或 材料 警示：GB/T 6682 5.1 Tris C4H11NO3,CAS77-86-1 5.2(LiCl)CAS7447-41-8 5.3 EDTA Na2 C10H16N2O8Na2 2H2O CAS60-00-4 5.4(SDS)C12H25NaO4S CAS151-21-3 5.5 PVP(C6H9NO)41 CAS9003-39-8 5.6-C2H6OS CAS60-24-2 5.7 acid phenol pH 4.3 5.8 C5H12O CAS123-51-3 5.9 Tris pH 8.0 5.10 CHCl3 CAS67-66-3 5.11 C2H6O CAS64-17-5 5.12 CH5N3 CHNS CAS593-84-0 5.13 C6H9Na3O9 CAS6132-04-3 DB13/T 2598 2017 3 5.14 C2H7NO2 CAS631-61-8 5.15 C15H28NO3 Na CAS137-16-6 5.16 C3H8O CAS67-63-0 5.17 NaCl CAS7647-14-5 5.18 NaOH CAS1310-73-2 5.19 Taq DNA-20 2 5.20 dATP dGTP dCTP dTTP dNTPs 5.21 BH3O3 CAS11113-50-1 5.22 C3H8O3 CAS56-81-5 5.23 C19H10Br4O5S CAS115-39-9 5.24 FF C25H27N2NaO7S2 CAS4463-44-9 5.25 C3H5NO CAS79-06-1 5.26 C7H10N2O2 CAS110-26-9 5.27 N N N N-TEMED C10H24N2 CAS150-77-6 5.28 H8N2O8S2 CAS7727-54-0 5.29 C2H4O2 CAS64-19-7 5.30 Na2O3S2 CAS7772-98-7 5.31 AgNO3 CAS7761-88-8 5.32 CH2O CAS50-00-0 5.33 1 mol/L Tris-HCl 溶液 121.1 g Tris HCl pH 7.5 1L 1.05 kg/cm2 15 min 4 5.34 4 mol/L LiCl 溶液 84.78 g LiCl 500 mL 5.35 15%(w/v)SDS 溶液 15 g SDS 800 mL 68 pH 7.5 100 mL,5.36 0.5 mol/L EDTA 溶液 187.61 g EDTA-Na2 2H2O 800 mL NaOH pH 7.5 1L 1.05 kg/cm2 15 min 4 DB13/T 2598 2017 4 5.37 溶液 20 g PVP 500 mL 100 mL 1 mol/L Tris-HCl 100 mL 0.5 mol/L EDTA 100 mL 15%SDS 37.5 mL LiCl 15 mL-1 L 4 5.38 24 1 5.39 25 24 1 5.40 溶液 236.32 g,147.05 g,115.62 g,10 g 800 mL,pH 5.2 1L 4 5.41 1.2 mol/L NaCl 溶液 35.06 gNaCl 500 mL 5.42 70%无 水乙 醇溶 液 5.43 加样缓 冲液 EDTA0.88g 0.05 g FF0.05 g 40 mL 36 mL 2 mol/L NaOH pH 7.0 100 mL 4 5.44 30%非 变性 聚丙 烯酰 胺溶 液 290 g 410 g 600 mL,1 L 4 5.45 10%过 硫酸 铵溶 液 10%g/mL 4 5.46 10Tris/硼酸 电泳 缓冲 液（10TBE）108 g Tris 7.44g Na2EDTA/55 g 1L 1.05 kg/cm2 15 min 4 5.47 1%硫 代硫 酸钠 1%g/mL 5.48 固定液 10%0.5%5.49 染色液 0.2%g/mL AgNO3 5.50 显影液 1.5%g/ml NaOH 0.4%DB13/T 2598 2017 5 6 仪器设 备 6.1 PCR 96 0.2 mL 6.2 12,000 g 6.3 6.4 2 L 10 L 20 L 100 L 200 L 1000 L 6.5-20 6.6 120 2 6.7 0.001 g 6.8 1 6.9 6.10 6.11 6.12 6.13 0.01 pH 6.14 6.15 230 nm 260 nm 280 nm 7 样品 1000 g 100 3 GB/T 3543.4-1995 4 7.1 扦样 GB/T 3543.2-1995 7.2 样品制 备 5 6 DNA B DNA 7.3 样品保 存 1 8 试验步 骤 8.1 PCR 反 应及 程序 DB13/T 2598 2017 6 PCR C 8.2 聚丙烯 凝胶 电泳 PCR D 9 试验数 据处 理 9.1 花生品 种纯 度的 计算 100 10 P 100(%)P 1 P 9.2 花生品 种真 实性 判定 A 57 DNA PCR C PCR D DNA 57 a)4 b)1 2 c)0 10 试验报 告（见附 录E）DB13/T 2598 2017 7 附 录 A（资料 性附 录）SSR 标 记信 息 表A.1 SSR 标 记信 息 1 AHGS1357 ATGGAGAATAACCAATGGCG ATCAAAGCGGAACACACACA 2 AHS1661 CAAAACTTCGAGCTCTTGCC CTCAGTTGCAGGCTAATGACA 3 Seq3A08 ATACGTGACTTGGGCCAGAC AGTGAAAAATACACCCAACGAA 4 TC42A05 GAACATGAAGGGACACACACAT AGAGAAGCTGGTTGGGTTGTAA 5 AHGS1171 CAAACAGCTCGTCGATTGAA ACGGGCTAACCCGATTAGAT 6 AHGS1197 CAAACAAAGCCCAAAGGAAA TGGACATTGCTTTTCTTGATTG 7 AHGS1214 GCTTCATTGAGATTGGGGAA CAGTTCTCAATAACAGAACCAGC 8 AHGS1241 GCTAAGCTAAATTACCCATTTTGTG GTTTGAGCTTGTGCAGTGGA 9 AHGS1251 GGATTCGGTGAAACGACACT GATGCCCTTTCTTCATCCAA 10 AHGS1278 GGAGCAGAATTCAGTTCATTTACA ACTGGAGCCTATTCTTCGCA 11 AHGS1286 CCCTCCAATCTTCTTCCCTC TTCAACCTCTTCGCTCTACCA 12 AHGS1329 CACATTAGTGAGTTTTTCCCCC AAAGGCTAATTGTTTAATTTTACTGC 13 AHGS1342 CTGCATAGTGGCGGTGATAA CATCGGATTAATTCAACGGT 14 AHGS1382 TTCCTGTGCCTTTTGGATTC CGAGATGAAGGTGGTGAGGT 15 AHGS1385 TCCCTTTGCTTGTTACCACA AATTTTGAAAGCGGGCATAA 16 AHGS1394 CGCCCAGGCTTATAGTGAAG ATCCTCACCCCGAGTCTTCT 17 AHGS1510 CCAGCCATAACCAACATCCT CAGCATGGATGACGTAGTGG 18 AHGS1573 TTCTTGGTTGAAATGACCCC GCTTACCACAGGTAAACCATCC 19 AHGS1594 CCGGCAGAACACTCTCTCTC GCGAGATAACTGCATCAGCA 20 AHGS1684 ATGGCAATGACAAGACACGA CGATGGTAACGAGCCCTAAA 21 AHGS1692 CCAAAACAAAGCAAAGGGAA ATCCCAACGAGACCACTCAG 22 AHGS1754 AAGTTGTTTGGAAAACCCCC CGATTTGTTCTTGCATGTGG 23 AHGS1790 GGACGATAGCAACATCAGCA GGGCTAAATTCAAACGCAAA 24 AHGS1886 TTCCTTTGAGCCTTTGCACT TGCTAATGAGGATCCATTGCT 25 AHGS1940 AACTCCGCGCCTATGTTCTA GGGAGAGGATGATGGTGGTA 26 AHGS1969 CCACTGTTTCGTTCCCTCAT GATTCAAACGAAACCGCATT 27 AHGS2108 AGCACTAGCCGAGTCCATGT CGTCGGATTTACTGACGGAT 28 AHGS2782 ATGCGGAACTCCACAATTTC TGACGTCGAGTTCATCAAGC 29 AhM086 GTGAAATTCTTCCCCGCATA TGCCTGTTGCCTACAGAAGA 30 AHS0049 TGCTTCTTCTCTCTGTCGCA GCCAGAACTGAGGGTGGATA 31 AHS0941 CATTGGAAGCAAATCAGCAA CACCCTAATTCCCCCAAGTT 32 AHS1480 TGGGCTCCAACAATACAACA TGTGTACAGGCATCATCGGT DB13/T 2598 2017 8 表A.1 SSR 标 记信 息()33 EE16 ATGGGACCACGAACATTTGA GAGCACGTTCAAGCACTCATT 34 Seq14H06 GCAACTAGGGTGTATGCCGT CAACCCTATACACCGAGGGA 35 GM2259 GGAAGCACCGATAGTTCCTCT TTCTGCTGCTTTCACTCATCA 36 GM2388 GTGAGGAGCATCTTGTGTGGT GAACTTCTTGCAAGGGAACAA 37 seq3B5 CCTCCCTGCTTGATCCAATA AACTGTAGCGAATGTGTTACATGG 38 GM1867 GAGCAGACATGGTTGAATGGT CACCTCAACGAAGAACTCAGC 39 GM1135 ACCAGGAAACCCACCAGTTAG CAACCCAAGTTTTGAACCTCA 40 GM1907 CACTGTCCTCTTCCCTCACTCT GGTGGACGAAGAAGAAGAAGAA 41 GM1641 ACACGTGTCCCTCAAACACA GTTGCAGAGCTCATCAAGCA 42 GM2536 AGCCTCCACCTTCTCCTATTG GATGCAGTGGAGGGATAACAA 43 GM1573 GAGACCGGAGACGGAGAGTAT ACGCCCATAGATTAACCCAGT 44 GM625 CCTCACTTCTTTTTGCATGGT TGGAAAGGAAATGATTTGGTG 45 GM2536 AGCCTCCACCTTCTCCTATTG GATGCAGTGGAGGGATAACAA 46 AHGS1127 CGTCGGAAATATCCGTCTGT CTGCACTCATCCCCTTCATT 47 AHGS1296 GAGGTATGGCGTCGTTTGAT GTGTTGCAAACACCTCCCTT 48 AHGS1692 CCAAAACAAAGCAAAGGGAA ATCCCAACGAGACCACTCAG 49 pPGPseq7G2 ACTCCCGATGCACTTGAAAT AACCTCTGTGCACTGTCCCT 50 PM375 CGGCAACAGTTTTGATGGTT GAAAAATATGCCGCCGTTG 51 GM1890 CTCTCCGATTATAGGCCAACC TGGCTTCTCCGTGAAAATAAC 52 GM1954 GAGGAGTGTGAGGTTCTGACG TGGTTCATTGCATTTGCATAC 53 GM635 TTGTGCGAAGGGTAAGATAGAAA TCCTGTGCTTGAATCTGGAAT 54 GM1996 CATCCCATCATTTTCCCTCTT TACAGTGAAGGTGGGATCCTG 55 GM660 TGAAAGTAACTCGTTTACAGTTTGAAG TCACTAAACATGTGGGTAACTAAGAAA 56 GM694 ATTTGTGCCCTACCACCTTCT TCCCTCCTAGAGGTTGACTTGA 57 GM2067 TCGCCAAGAAGAACAAAACAC CTGGTCGAAGAAGGGTTCTCT 注：57 DB13/T 2598 2017 9 附 录 B（规范 性性 附录）花生种 子基 因组 总DNA 提 取方法 B.1 1 g 1.2 g 40 mL B.2 10 mL 5.37 B.3 5 mL pH4.3 5.7 5 min B.4 5 mL 5.38 5 min B.5 12000 g 4 10 10 min 9 mL 9 mL pH 5.2 II 5.40 40 mL 10 min B.6 4.5 mL 5.39 5 min B.7 12000 g 10 min 16 mL 40 mL B.8 9 mL 1.2 M NaCl 9 mL 1 h B.9 12000 g 15 min 2 mL 70%B.10 4 mL 4 mL 4 M LiCl 1 h B.11 12000 g 4 15 min B.12 8 mL 40 mL 8 mL 12000 g 4 15 min B.13 2 mL 70%200 L B.14 6.15 DNA DN A 5 L 995 L 260 nm 280 nm OD DNA OD260/OD280 DNA OD260/OD280 1.7 1.8 DB13/T 2598 2017 10 附 录 C（规范 性附 录）PCR 反 应及 程序 C.1 PCR 扩增 反应 体系 PCR 1 表C.1 推 荐反 应体 积（10 L）L 10 PCR 10 1 1.0 dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.2 Taq 5.0 U/L 0.1 U/L 0.2 10 mol/L 0.5 mol/L 0.5 10 mol/L 0.5 mol/L 0.5 DNA 15 ng/L 30 ng/L 2.0 DNA free-5.6 C.2 PCR 扩增 反应 程序 94 5 min 55 35(94 1 min 55 30 s 72 45 s)72 10 min 4 DB13/T 2598 2017 11 附 录 D（规范 性附 录）10%非 变性 聚丙 烯酰 胺凝 胶 电泳 D.1 电 泳样 品准 备 PCR 2 L D.2 凝 胶制 备 75%2 3 25.1 mL ddH2O 10TBE 4 mL 30%10.6 mL 26 L TEMED 10%AP 560 L D.3 预 电泳 1 TBE 200 V 10 min 30 min D.4 电泳 1 L 2 L DNA marker 200V 250 V 45 min 60 min FF D.5 拆胶 D.6 固 定：10 min D.7 漂 洗：ddH2O 6 min D.8 银 染：3 min 5 min D.9 漂 洗：ddH2O 15 s D.10 显影：D.11 漂洗：5 min 10 min D.12 记录：DB13/T 2598 2017 12 附 录 E（规范 性附 录）河北农 业大 学农 学院 检验 报告 NO 2018 河北农业 大学农学 院 检验报告 _ _ _ _ 1 DB13/T 2598 2017 13 注 意 事 项 2 DB13/T 2598 2017 14 农作 物种子 检验机构 检验报 告 NO 2018 3 _