湖南省地方标准DB43DB43/T 1670 2019 ICS 65.020.30B 41湖南省市场监督管理局 发 布2019-10-15发布 2019-12-15实施非洲猪瘟病毒检测 免核酸提取荧光 PCR法Detection of African Swine Fever Virus Real-time PCR without DNA Extraction Method DB43/T 1670 2019 I 目 次 前言 1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 主要仪器设备 15 主要耗材 16 试剂 27 样品处理 28 样品检测 39 结果判定 310 生物安全要求 3附录 A（规范性附录）试剂的配制 4 DB43/T 1670 2019 II 前 言 本标准按 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省畜牧水产局提出，由湖南省农业农村 厅归口。本标准起草 单位：湖南省 动 物 疫病预防控 制 中心、湖南 国 测生物 科技有限公司。本标准主要起草 人：何世成、王昌建、刘道新、喻正军、石建、范 叶、林源、唐小明、黄建龙。DB43/T 1670 2019 1 非洲猪瘟病毒检测 免核酸提取荧光 PCR法 1 范围 本标准规定 了免核酸 提 取 检测 非洲猪瘟病毒核酸 的 荧光 PCR方法。本标准 适 用 于我 省范围内 开展非洲猪瘟病毒核酸快速 检测。2 规范性引用文件 下列 文件 对于 本文件的 应 用 是必 不可 少 的。凡是 注 日期 的引用文件，仅所 注 日期 的 版 本 适 用 于 本文件。凡是 不注 日期 的引用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改单）适 用 于 本文件。GB 19489 实验室 生物安全 通 用要求 NY/T 541 兽医诊断 样品 采集、保存 与运输 技 术规范 NY/T 1948 兽医实验室 生物安全要求 通 则 3 术语和定义 下列 术语和定义 适 用 于 本文件。3.1 非洲猪瘟（African Swine fever，ASF）由 非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）引起的 猪 的 一种急 性、热 性、高度接触 性 传染病，其 发 病 率 和 病 死率均 可 达到 100%，是世 界 动 物 卫 生 组织（OIE）的 法 定 报告传染 病，在 我国 属 于 一 类 动 物 疫病。3.2 荧光 PCR 实 时 荧光 聚合酶链式反 应（Real-time polymerase chain reaction）。4 主要仪器设备 荧光 PCR仪；台式离 心 机（转 速 12 000 r/m）；小 型离 心 机（转 速 6 000 r/m）；-20冰箱；微量移液 器（0.2 2.5）L、（1 10）L、（10 100）L、（20 200）L、（100 1 000）L等 规格；组织匀浆 仪；高压灭菌锅；分析天平（精度 0.01g）；生物安全 柜。5 主要耗材 无 DNase/RNase 1.5 mL离 心 管；与 荧光 PCR仪 匹 配的 PCR薄壁管或 8联排管；与移液 器配 套 的 各规 格吸头。DB43/T 1670 2019 26 试剂 6.1 引物与探针 引物和 探针 的设 计基 于 ASFV vp72基因序 列，序 列 如 下：a)上游 引物：5-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3，使 用 浓度为 20 mol/L。b)下 游 引物：5-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3，使 用 浓度为 20 mol/L。c)探针：5-FAM-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3，使 用 浓度为 10 mol/L。6.2 核酸释放剂 核酸 释放 剂配制 方法 见 附录 A.1。6.3 荧光 PCR试剂 6.3.1 Taq DNA聚合酶，浓度为 5 U/L。6.3.2 尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶），浓度为 2 U/L。6.3.3 dNTPs：由 等量 dATP、dUTP、dGTP、dCTP组 成，终 浓度为 25 mmol/L。6.3.4 2 PCR缓冲 液：配制 方法 见 附录 A.2。6.4 阴性与阳性对照 6.4.1 阳 性 对 照：灭 活 的 非洲猪瘟病毒 阳 性样品，Ct值 30，-20 保存 备用。6.4.2 阴 性 对 照：非洲猪瘟病毒核酸 阴 性样品，-20 保存 备用。7 样品处理 7.1 样品类型 猪 脾脏、淋巴 结 等组织 样品，血清、抗凝血，拭子 样品。样品的 采集、保存 与运输 按 照 NY/T 541的规定 执行。7.2 样品预处理 不 同 类型 样品 预 处理 方法 如 下：a）组织 样品：剪 取 待 检 组织 约 50 mg置 于 1.5 mL离 心 管 中，加入 200 L PBS（0.01 mol/L，pH 7.2），使 用 组织匀浆 仪 研磨 成 悬 液，12 000 r/m离 心 1 min，取 上 清待 检。b）血清 或 抗凝血 样品：无 需 预 处理。c）拭子 样品：准备 1.5 mL 离 心 管，加入 1 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2），将拭子置入 管 中，振荡后 取 浸泡 液 待 检。7.3 样品灭活 将 预 处理 后 的 待 检样品 经 60 30 min灭 活。7.4 样品保存 样品 在 2 8 条 件 下保存应 不 超过 24 h，超 24h后 检测 需冷冻 保存。DB43/T 1670 2019 3 8 样品检测 8.1 核酸释放 8.1.1 在 样品制备 区，吸 取核酸 释放 剂 100 L于 1.5 mL离 心 管 中，加入已 灭 活待 检样品 10 L20 L，充 分 混 匀。85 95 处理 10 min，然后 12 000 r/m离 心 1 min，取 上 清 液 作 为 模板立即进 行 荧光 PCR检测。同 时 设 立阴 性 对 照、阳 性 对 照。8.1.2 待 检样品 也 可 使 用 商 品 化 病毒核酸 提 取 试剂 盒进行 DNA提 取，操作 按试剂 盒说 明 书进行。8.2 荧光 PCR检测 8.2.1 反 应 体系 配制：根据待 检样品 数 量，在 试剂准备 区 按 比例 配制 反 应 体系：Taq DNA聚合酶 0.5 L、UNG酶 0.25 L、dNTPs 0.25 L、2 PCR缓冲 液 12.5 L、上 下 游 引物 各 0.75 L、探针 0.5 L、无 DNase/RNase水 4.5 L。充 分 混 匀 后，20 L/管分 装，转移 至 样品制备 区加 样。8.2.2 加 样：吸 取 5 L模板加至 反 应 体系，转移到 扩增区。8.2.3 扩增：将 反 应 管 置 于荧光 PCR仪 中，选择 FAM通道 进行 检测，设 置 反 应 体系 为 25 L，反 应 程 序如 下：第 一 阶段，预 反 应 50/2 min；第二阶段，预 变 性 95/2 min；第三阶段，95/15 s，退火、延伸、荧光 收 集 60/30 s（收 集荧光），40个循环；第四阶段，冷却 25/10 s。9 结果判定 9.1 基线设置 反 应 结 束后，保存 结果，仪器 对 结果 进行自 动 分析，给出 Ct值。注意 查看 结果的 扩增 曲线 的 形状，存 在 Ct值 的结果 呈 S型 扩增 曲线。也 可 根据 实 际情况 自行 调整：基 线 起 点 值 调 至 3 15、基 线 终 点 值调 至 5 20，调整 阴 性 对 照 的 扩增 曲线 使 其 平 直 或 低 于 阈 值 线，使各 项参 数 符 合 下 述“9.2 实验有 效 性”中 的要求。9.2 实验有效性 当 阳 性 对 照 Ct值 30、呈 S型 扩增 曲线，阴 性 对 照 无 Ct值 时，实验成 立，否 则 实验 结果 无 效。9.3 结果判定 样品 Ct值 35且呈 S型 扩增 曲线，结果判定 为 ASFV核酸 阳 性。样品 Ct值 在 35 40之间，结果判定可 疑，需 重复 检测 一 次，复 检 无 Ct值，判定 为 ASFV核酸 阴 性，反 之 为 阳 性。样品 无 Ct值 或无 S型 扩增 曲线，结果判定 为 ASFV核酸 阴 性。10 生物安全要求 检测 过程 及 实验室 废弃 物处 置 应 遵守 GB 19489、NY/T 1948等 生物安全 管 理 相关 要求。DB43/T 1670 2019 4 附录 A（规范性附录）试剂的配制 A.1 核酸释放剂配制方法 NaOH 0.8 g KCl 3.73 g EDTA 0.37 g Triton X-100 1 mL 加 无 DNase/RNase水 充 分 溶解，并 定容 至 1000 mL，分 装 备用。A.2 2 PCR缓冲液配制方法 Tris碱 24.2 g MgCl2 6H2O 2.03 g KCl 7.46 g(NH4)2SO4 1.3 g 甘油 80 ml 加 无 DNase/RNase水 充 分 溶解，使 用 浓 盐 酸 将 溶 液 pH值 调 至 8.3，并 定容 至 1000 mL，分 装 备用。