I C S 6 5.0 2 0.0 1B 1 6DB61陕 西 省 地 方 标 准D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 8番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 检 验 鉴 定 方 法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f T o m a t o y e l l o w l e a f c u r l v i r u s2 0 1 8-0 4-1 0 发 布 2 0 1 8-0 5-1 0 实 施陕 西 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 8I目 次前 言.I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 基 本 信 息.14 方 法 原 理.15 实 验 用 仪 器 设 备、用 具 及 试 剂.16 取 样 和 样 品 制 备.27 检 测 方 法.28 结 果 判 定.29 结 果 记 录 与 样 品、资 料 保 存.21 0 安 全.3附 录 A（规 范 性 附 录）T Y L C V 相 关 资 料.4附 录 B（规 范 性 附 录）双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 方 法.7附 录 C（规 范 性 附 录）普 通 P C R 检 测 方 法.1 1附 录 D（规 范 性 附 录）实 时 荧 光 P C R 检 测 方 法.1 4附 录 E（规 范 性 附 录）生 物 学 接 种.1 6D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 8I I前 言本 标 准 按 照 G B/T 1.1 2 0 0 9 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 陕 西 省 农 业 厅 提 出 并 归 口。本 标 准 起 草 单 位：陕 西 省 生 物 农 业 研 究 所、陕 西 省 园 艺 蚕 桑 技 术 工 作 站、陕 西 学 前 师 范 学 院。本 标 准 主 要 起 草 人：李 英 梅、杨 苗 苗、王 周 平、刘 晨、张 伟 兵、张 锋、洪 波、陈 志 杰、张 淑 莲。本 标 准 由 陕 西 省 生 物 农 业 研 究 所 负 责 解 释。本 标 准 首 次 发 布。联 系 信 息 如 下：单 位：陕 西 省 生 物 农 业 研 究 所电 话：0 2 9 8 2 2 9 1 0 5 9地 址：西 安 市 咸 宁 中 路 1 2 5 号邮 编：7 1 0 0 4 3D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 81番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 检 验 鉴 定 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 酶 联 免 疫 吸 附 D A S-E L I S A、普 通 P C R、实 时 荧 光 定 量 P C R 检 测 方 法。本 标 准 适 用 于 番 茄 种 苗 及 传 毒 介 体 中 携 带 的 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 的 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B 1 9 4 8 9-2 0 0 8 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求G B/T 2 3 6 2 9-2 0 0 9 引 进 植 物 病 原 生 物 安 全 控 制 技 术 要 求3 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 基 本 信 息中 文 名：番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒英 文 名：t o m a t o y e l l o w l e a f c u r l v i r u s英 文 缩 写：T Y L C V分 类 地 位：双 生 病 毒 科（G e m i n i v i r i d a e）菜 豆 金 色 花 叶 病 毒 属（B e g o m o v i r u s）番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 其 他 信 息 见 附 录 A。4 方 法 原 理通 过 基 于 抗 原 抗 体 反 应 的 双 抗 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 D A S-E L I S A、普 通 P C R、实 时 荧 光 定 量 P C R 进 行 检 测鉴 定。5 实 验 用 仪 器 设 备、用 具 及 试 剂5.1 仪 器 设 备酶 联 检 测 仪、洗 板 机、高 速 冷 冻 离 心 机、P C R 仪、荧 光 定 量 P C R 仪、电 子 天 平（感 量，1/1 0 0 0 0 g）、电 泳 仪、电 泳 槽、紫 外 投 射 仪、凝 胶 成 像 系 统、恒 温 水 浴、低 温 冰 箱、液 氮 罐、隔 离 温 室 等。5.2 用 具可 调 式 微 量 移 液 器（0.5 L、2 L、1 0 L、2 0 L、1 0 0 L、2 0 0 L、1 0 0 0 L）、9 6 孔 光 化 学 P C R反 应 板、酶 联 板、离 心 管、P C R 管、研 钵 等。5.3 试 剂酶 联 测 定 试 剂，P C R 检 测 试 剂，除 有 特 殊 说 明 外，均 为 分 析 纯 或 生 化 试 剂。D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 826 取 样 和 样 品 制 备6.1 取 样6.1.1 疑 似 被 T Y L C V 感 染 的 番 茄 植 株 取 样 方 法：取 疑 似 发 病 植 株 顶 部 叶 片 2 片 3 片，-2 0 储 存 备 用。6.1.2 无 T Y L C V 感 染 症 状 番 茄 植 株 取 样 方 法：在 番 茄 田 随 机 选 5 点，每 点 随 机 选 5 株，每 株 取 顶 部 叶片 2 片 3 片，-2 0 储 存 备 用。6.1.3 若 在 取 样 过 程 中 发 现 烟 粉 虱，应 随 机 采 集 烟 粉 虱，-2 0 储 存 备 用。6.2 实 验 室 样 品 制 备6.2.1 植 物 样 品：将 每 份 1 0 g 待 测 番 茄 叶 片 放 入 研 钵 后 加 入 液 氮 研 磨，取 1 0 0 m g 按 照 植 物 基 因 组 试 剂盒 抽 提 番 茄 叶 片 总 D N A，-2 0 保 存 所 提 D N A。6.2.2 烟 粉 虱 样 品：取 单 头 烟 粉 虱 按 照 动 物 基 因 组 提 取 试 剂 盒 抽 提 D N A，-2 0 保 存 所 提 D N A。7 检 测 方 法7.1 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 方 法 见 附 录 B。7.2 P C R 检 测 方 法 见 附 录 C。7.3 实 时 荧 光 定 量 P C R 检 测 方 法 见 附 录 D。7.4 生 物 学 测 定 方 法 见 附 录 E。8 结 果 判 定8.1 样 品 经 酶 联 免 疫 吸 附、普 通 P C R、实 时 荧 光 定 量 P C R 三 种 方 法 之 一 检 测 为 阴 性 时，判 定 样 品 不 携带 T Y L C V。8.2 普 通 P C R、实 时 荧 光 定 量 P C R 中 的 两 种 方 法 检 测 结 果 为 阳 性，应 进 行 序 列 测 定，如 序 列 测 定 结 果证 实 与 所 检 测 的 T Y L C V 一 致，即 可 判 定 检 出 T Y L C V。8.3 酶 联 测 定 为 阳 性 后，普 通 P C R 或 实 时 荧 光 P C R 检 测 结 果 为 阳 性 可 判 定 检 出 T Y L C V。必 要 时 可 进 行生 物 学 测 定，并 进 行 复 检。9 结 果 记 录 与 样 品、资 料 保 存9.1 结 果 记 录检 验 结 果 应 形 成 检 验 报 告，内 容 包 括 取 样 品 种、时 间、地 点、人 员、样 品 类 型，样 品 保 存 条 件；实验 时 间、地 点、方 法、结 果，检 验 人 员 签 字 等。9.2 样 品 保 存经 检 验 确 定 携 带 T Y L C V 的 样 品 保 存 在-8 0 冰 箱，标 记 样 品 并 登 记。9.3 资 料 保 存酶 联 测 定 需 有 酶 联 极 反 应 的 原 始 数 据，普 通 P C R 检 测 需 有 电 泳 结 果 照 片 及 序 列 测 定 报 告，荧 光 定 量P C R 检 测 需 有 扩 增 曲 线 图 片，生 物 学 测 定 需 有 鉴 别 寄 主 的 症 状 图 片。D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 831 0 安 全实 验 过 程 中 的 生 物 安 全 要 求 应 严 格 按 照 G B 1 9 4 8 9-2 0 0 8 的 规 定 进 行 操 作，实 验 废 弃 物 按 照 G B/T2 3 6 2 9-2 0 0 9 中 相 关 要 求 进 行 处 理。D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 84A A附 录 A（规 范 性 附 录）T Y L C V 相 关 资 料A.1 生 物 学 特 性A.1.1 主 要 寄 主 作 物T Y L C V 的 自 然 寄 主 有 番 茄（L y c o p e r s i c u m e s c u l e n t u m M i l l.）、烟 草（N i c o t i a n a t a b a c u m）、茄子（S o l a n u m m e l o n g e n a）、南 瓜（C u c u r b i t a m o s c h a t a）、木 薯（M a n i h o t e s c u l e n t a c r a n t z）、棉花（G o s s y p i u m h i r s u t u m）、辣 椒（C a p s i c u m a n n u u m L.）等。A.1.2 野 生 寄 主野 生 寄 主 有 曼 陀 罗（D a t u r a s t r a m o n i u m）等。A.1.3 病 毒 侵 染 部 位茎 秆、叶 片、果 实。A.2 病 害 症 状A.2.1 番 茄 受 害 症 状：寄 主 植 株 感 染 T Y L C V 后，初 期 主 要 表 现 生 长 迟 缓 或 停 滞，顶 部 叶 片 常 退 绿 发 黄，变 小变 厚，叶 质 脆 硬，叶 片 有 褶 皱、向 上 卷 曲，叶 片 边 缘 至 叶 脉 区 域 黄 化 节 间 变 短，植 株 明 显 矮 化，下 部 老 叶症 状 不 明 显（见 图 A.1、图 A.2）；番 茄 植 株 具 有 明 显 曲 叶 症 状 外，后 期 表 现 坐 果 少，果 实 变 小，膨 大 速 度慢，成 熟 期 的 果 实 不 能 正 常 转 色，果 实 产 量 和 商 品 价 值 均 大 幅 度 下 降。A.2.2 烟 草 受 害 症 状：寄 主 植 株 感 染 病 毒 后，株 叶 脉 增 粗 叶 片 脊 面 出 现 耳 突，叶 片 有 卷 曲、黄 化 现 象。A.2.3 辣 椒 受 害 症 状：植 株 受 害 后，叶 片 卷 曲、黄 化。图 A.1 T Y L C V 侵染后的番茄叶片D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 85图 A.2 T Y L C V 侵染后的番茄植株A.3 分 布 区 域T Y L C V 主 要 分 布 于 亚 洲、非 洲、欧 洲、美 洲、大 洋 洲。A.4 传 播 方 式烟 粉 虱（B e m i s i a t a b a c i）是 唯 一 的 传 播 媒 介，各 种 生 物 型 的 烟 粉 虱 均 可 传 播。A.5 粒 体 形 态番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 粒 体 呈 孪 生 颗 粒 状，大 小 约 3 0 n m 2 0 n m。A.6 基 因 组为 单 链 环 状 D N A，大 小 约 为 2.8 k b，基 因 数 6 个，基 因 组 含 有 4 个 O R F s（A C 1，A C 2，A C 3，A C 4）。D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 86B B附 录 B（规 范 性 附 录）双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 方 法B.1 材 料B.1.1 酶 联 板 的 要 求使 用 有 质 量 保 证 厂 商 生 产 的 酶 联 板。B.1.2 包 被 抗 体特 异 性 的 T Y L C V 抗 体。B.1.3 酶 标 抗 体碱 性 磷 酸 酯 酶 标 记 的 T Y L C V 抗 体。B.1.4 底 物对 硝 基 苯 磷 酸 二 钠（N P P）。B.1.5 样 品 抽 提 缓 冲 液。样 品 抽 提 缓 冲 液（p H 7.4）应 符 合 表 B.1。表 B.1 样品抽提缓冲液试剂 用量亚硫酸钠（N a2S O3）1.3 0 g聚乙烯基吡咯烷酮（P V P，M W 2 4 0 0 0 M W 4 0 0 0 0）2 0.0 g叠氮化钠（N a N3）0.2 0 g吐温（T w e e n-2 0）2 0 m L注：溶于9 0 0 m L，1 P B S T 中，N a O H 或H C l 调节p H 值至7.4，定容至1 0 0 0 m L，4 储存。B.1.6 包 被 缓 冲 液包 被 缓 冲 液（p H 9.6）应 符 合 表 B.2。表 B.2 包被缓冲液试剂 用量碳酸钠（N a2C O3）1.5 9 g碳酸氢钠（N a H C O3）2.9 3 g叠氮钠（N a N3）0.2 0 g注：加入9 0 0 m L 蒸馏水溶解，H C l 调节p H 值到9.6。蒸馏水定容至1 0 0 0 m L，4 储存。B.1.7 P B S T 缓 冲 液（洗 涤 缓 冲 液 p H 7.4）D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 87P B S T 缓 冲 液（洗 涤 缓 冲 液 p H 7.4）应 符 合 表 B.3。表 B.3 P B S T 缓冲液试剂 用量氯化钠（N a C l）8.0 0 g磷酸氢二钠（N a2H P O4）1.1 5 g磷酸二氢钾（K H2P O4）1.2 0 g氯化钾（K C l）0.2 0 g吐温（T w e e n-2 0）0.5 0 m L注：加入9 0 0 m L 蒸馏水溶解，用N a O H 或H C l 调节p H 值至7.4，用蒸馏水定容至1 0 0 0 m L，4 储存。B.1.8 酶 标 抗 体 稀 释 缓 冲 液（p H 7.4）酶 标 抗 体 稀 释 缓 冲 液（p H）应 符 合 表 B.4。表 B.4 酶标抗体稀释缓冲液试剂 用量1 P B S T 缓冲液 8 0 0 m LB S A（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉 2.0 gP V P（M W 2 4 0 0 0 M W 4 0 0 0 0）2 0.0 g叠氮钠（N a N 3）0.2 g注：用 N a O H 或 H C l 调节 p H 值到 7.4，用无菌蒸馏水定容至 1 0 0 0 m L，4 储存。B.1.9 底 物（p N P P）缓 冲 液（p H 9.8）底 物（p N P P）缓 冲 液（p H 9.8）应 符 合 表 B.5。表 B.5 底物（p N P P）缓冲液（p H 9.8）试剂 用量氯化镁（M g C l2）0.1 g叠氮钠（N a N 3）0.2 g二乙醇胺 9 7 m L注：溶解于 8 0 0 m L 蒸馏水中，盐酸调p H 9.8，蒸馏水定容至1 0 0 0 m L，4 储存。B.2 程 序B.2.1 包 被 抗 体用 包 被 缓 冲 液 将 抗 体 按 说 明 稀 释，加 入 酶 联 板 的 孔 中，1 0 0 L/孔，加 盖，3 7 孵 育 4 h 或 4 冰 箱 中孵 育 过 夜，清 空 酶 联 孔 中 溶 液，P B S T 洗 涤 4 次 6 次，每 次 3 m i n。B.2.2 样 品 制 备待 测 样 品 按 1:1 0（质 量：体 积）加 入 抽 提 缓 冲 液，用 研 钵 研 磨 成 浆，2 0 0 0 r/m i n，离 心 1 0 m i n，上 清液 即 为 制 备 好 的 检 测 样 品。样 品 提 取 缓 冲 液 作 空 白 对 照，阴 性 对 照 作 相 应 的 处 理 或 按 照 说 明 书 进 行。D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 88B.2.3 加 样加 入 制 备 好 的 检 测 样 品、阴 性 对 照，1 0 0 L/孔，每 一 样 品 设 一 个 重 复。加 盖 后 于 4 冰 箱 孵 育 过 夜，酶 联 板 用 自 来 水 彻 底 冲 洗，再 用 蒸 馏 水 洗 涤 1 次，P B S T 洗 涤 3 次，每 次 3 m i n。B.2.4 加 酶 标 抗 体用 酶 标 抗 体 缓 冲 液 按 说 明 将 酶 标 抗 体 稀 释 至 工 作 浓 度，并 加 入 到 酶 联 板 中，1 0 0 u L/孔，加 盖，3 7 孵 育 4 h，酶 联 板 用 自 来 水 彻 底 冲 洗，再 用 蒸 馏 水 洗 涤 1 次，P B S T 洗 涤 3 次，每 次 3 m i n。B.2.5 加 底 物将 底 物 p N P P 加 入 到 底 物 缓 冲 液 中 使 终 浓 度 为 1 m g/m L（现 用 现 配），按 1 0 0 L/孔，加 入 到 酶 联 板 中，室 温 避 光 孵 育。B.2.6 读 数用 酶 联 检 测 仪 在 3 0 m i n、1 h 和 2 h 于 4 0 5 n m 处 读 O D 值。或 用 肉 眼 观 察 显 色 情 况。B.3 结 果 判 断B.3.1 对 照 孔 的 O D4 0 5值（缓 冲 液 孔、阴 性 对 照 及 阳 性 对 照 孔），应 该 在 质 量 控 制 范 围 内，即：缓 冲 液 孔和 阴 性 对 照 孔 的 O D4 0 5值 0.1 5，当 阴 性 对 照 孔 的 O D4 0 5值 0.0 5 时，按 0.0 5 计 算。阳 性 对 照 有 明 显 的 颜 色反 应；阴 性 对 照 O D4 0 5值/阴 性 对 照 O D4 0 5值 2；孔 的 重 复 性 基 本 一 致。B.3.2 在 满 足 了 B.3.1 质 量 要 求 后，结 果 原 则 上 可 判 断 如 下：a)样 品 O D4 0 5值/阴 性 对 照 O D4 0 5值 明 显 2，判 为 阳 性；b)样 品 O D4 0 5值/阴 性 对 照 O D4 0 5值 在 阈 值 附 近，判 为 可 疑 样 品，需 重 新 做 一 次，或 用 其 他 方 法 加 以验 证；c)样 品 O D4 0 5值/阴 性 对 照 O D4 0 5值 明 显 2，判 为 阴 性。B.3.3 若 满 足 不 了 B.3.1 质 量 要 求，则 不 能 进 行 结 果 判 定。D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 89C C附 录 C（规 范 性 附 录）普 通 P C R 检 测 方 法C.1 试 剂C.1.1 电 泳 缓 冲 液（T A E）（5 0）电 泳 缓 冲 液（T A E）（5 0）应 符 合 表 C.1。表 C.1 电泳缓冲液（5 0 T A E）试剂 用量三羟甲基氨基甲烷（T r i s）2 4 2 g冰乙酸 5 7.1 m L0.5 m o l/L 乙二胺四乙酸二钠（E D T A，p H 8.0）1 0 0 m L注：用时加蒸馏水稀释至 1 T A E。C.1.2 溴 化 乙 锭（E B）溶 液（1 0 g/L）溴 化 乙 锭（E B）溶 液（1 0 g/L）应 符 合 表 C.2。表 C.2 溴化乙锭（E B）溶液（1 0 g/L）试剂 用量溴化乙锭 2 0 m g灭菌去离子水 2 0 m LC.2 实 验 步 骤C.2.1 植 物 总 D N A 提 取按 照 植 物 D N A 提 取 试 剂 盒 进 行 操 作。C.2.2 烟 粉 虱 总 D N A 提 取按 照 动 物 D N A 提 取 试 剂 盒 进 行 操 作。C.2.3 引 物C.2.3.1 T Y L C V-F：5-T A A A T A C C A T G G C C G C G C A G C G G A A T A C A C G A C G T T C-3。C.2.3.2 T Y L C V-R：5-T A T A A T C C A T G G A G A C C C A T A A G T A T T G T C A T T G A G G G T G A-3。C.2.3.3 扩 增 片 段 长 度 为 5 4 3 b p。C.2.4 P C R 反 应D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 81 0P C R 反 应 体 系 见 表 C.1，每 个 样 品 设 2 个 平 行 处 理。反 应 体 系 中 各 试 剂 的 量 可 根 据 具 体 情 况 或 不 同 的反 应 总 体 积 适 当 调 整。检 测 时 以 含 T Y L C V 病 毒 材 料 的 D N A 或 含 有 T Y L C V 目 标 片 段 的 质 粒 作 为 阳 性 对 照，以健 康 植 物 材 料 作 为 阴 性 对 照，以 水 代 替 模 板 作 为 空 白 对 照。反 应 条 件：9 5，1 0 m i n；9 5，3 0 s，6 2，4 0 s；7 2，1 m i n，3 5 个 循 环；7 2，1 0 m i n；1 0，保 持。表 C.3 P C R 反应体系名称 上样量P r e m i x T a q 2 5 LD N A 模板 5 L上游引物（0.1 m/L）2 L下游引物（0.1 m/L）2 L无菌水 1 6 L总体积 5 0 LC.2.5 琼 脂 糖 电 泳配 制 1.0%（质 量 浓 度）的 琼 脂 糖 凝 胶。溴 化 乙 铵 可 直 接 加 入 琼 脂 糖 凝 胶 中（浓 度 为 0.5 g/m L），也 可 在 电 泳 完 成 后 用 溴 化 乙 锭 染 色。C.2.6 结 果 判 定C.2.6.1 阳 性 对 照 在 5 4 3 b p 处 有 扩 增 片 段，阴 性 对 照 和 空 白 对 照 无 特 异 扩 增，带 测 样 品 在 5 4 3 b p 无 条 带，则 可 判 定 样 品 为 T Y L C V 阴 性。C.2.6.2 阳 性 对 照 在 5 4 3 b p 处 有 扩 增 片 段，阴 性 对 照 和 空 白 对 照 无 特 异 性 扩 增，待 测 样 品 出 现 与 阳 性 对照 一 致 的 扩 增 条 带，可 通 过 测 序 的 方 式 进 一 步 确 认。如 果 P C R 产 物 序 列 与 T Y L C V 的 序 列 同 源 性 达 到 9 9%及以 上，则 可 判 定 样 品 为 T Y L C V 阳 性，未 扩 增 到 5 4 3 b p 的 条 带，则 判 定 为 阴 性。D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 81 1D D附 录 D（规 范 性 附 录）实 时 荧 光 P C R 检 测 方 法D.1 引 物D.1.1 T Y L C V 检 测 引 物D.1.1.1 Y G-3：5-G A G T T C C C C T G T G C G T G A A-3。D.1.1.2 Y G-5：5-C T G T T C G C A A G T A T C A A T C A A G G T-3。D.2 D N A 提 取D N A 提 取 应 按 本 标 准 C.2.1 和 C.2.2 的 要 求 进 行。D.3 实 时 荧 光 R T-P C R 检 测P C R 反 应 体 系 见 表 D.1，每 个 样 品 设 2 个 平 行 处 理。反 应 体 系 中 各 试 剂 的 量 可 根 据 具 体 情 况 或 不 同 的反 应 总 体 积 进 行 适 当 的 调 整。检 测 时 以 含 T Y L C V 材 料 的 D N A 或 含 有 T Y L C V 的 质 作 为 阳 性 对 照，以 健 康 植 物材 料 作 为 阴 性 对 照，以 水 代 替 模 板 作 为 空 白 对 照。反 应 参 数：5 2，2 m i n；9 5，1 m i n；9 5，5 s；6 0，3 0 s；7 2，3 4 s（收 集 荧 光 信 号）；4 0 个 循 环。溶 解 曲 线 程 序：9 5，1 5 s；6 0，1 m i n；9 5，3 0 s（收 集 荧 光 信 号）；6 0，1 5 s。表 D.1 实时荧光 R T-P C R 反应体系试剂名称 加样量S Y B R P r e m i x D i m e r E r a s e r(2)1 0 LR e f e r e n c e D y e I I 0.4 L引物 Y G-3 0.6 L引物 Y G-5 0.6 Ld d H2O 7.4 LD N A 模板 1 L总体积 2 0 LD.4 结 果 判 定D.4.1 检 测 样 品 的 C t 值 不 小 于 4 0 或 无 C t 值 时，则 判 定 T Y L C V 阴 性。D.4.2 检 测 样 品 的 C t 值 不 大 于 3 5 时，则 判 定 T Y L C V 阳 性。D.4.3 检 测 样 品 的 C t 值 小 于 4 0 而 大 于 3 5 时，应 重 新 进 行 测 试，如 果 重 新 测 试 的 C t 值 大 于 或 者 等 于 4 0 时，则判 定 T Y L C V 阴 性，如 果 重 新 测 试 的 C t 值 小 于 4 0，则 判 定 T Y L C V 阳 性。D B 6 1/T 1 1 3 4 2 0 1 81 2E E附 录 E（规 范 性 附 录）生 物 学 接 种E.1 接 种病 叶 加 1：3（质 量：体 积）的 磷 酸 盐 缓 冲 液（0.0 1 m o l/L，p H 7.2）于 研 钵 中 充 分 研 碎，在 接 种 植 物叶 片 表 面 均 匀 洒 上 硅 藻 土，用 手 指 蘸 取 研 磨 好 的 汁 液 轻 轻 涂 抹 在 叶 片 表 面。E.2 寄 主 及 症 状E.2.1 鉴别寄主E.2.1.1 番 茄（L y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u m M i l l.）：系 统 感 染。E.2.1.2 烟 草（N i c o t i a n a t a b a c u m）：系 统 感 染；株 叶 脉 增 粗 叶 片 脊 面 出 现 耳 突，叶 片 有 卷 曲、黄 化。E.2.1.3 辣 椒（C a p s i c u m f r u t e s c e n s L.）：系 统 感 染；叶 片 卷 曲、黄 化。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _