ICS 11.220 B 41 备案号：56329-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 26282017 鹅细小病毒检测 聚合酶链式反应（PCR）法Detection method of polymerase chain reaction for goose parvovirus 2017 06-12发布 2017-08-12实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 26282017 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林省动物疾病预防控制中心、吉林省畜牧总站、吉林省牧业信息中心、梅河口市畜牧总站、榆树市动物卫生监督所。本标准主要起草人：邵洪泽、黄海楠、孙亮、董航、李昱洁、王楠、郭衍冰、毛文智、呼延含蓉、卢松岩、张涛、李桂华、陆秀娟。DB22/T 26282017 1 鹅细小病毒检测 聚合酶链式反应（PCR）法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了鹅细小病毒检测方法的操作步骤和结果判定。本标准适用于鹅细小病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测，所有培养物和废弃物应按照GB 19489中的有关规定执行。4 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。实验室应根据实验要求分为相对独立的工作区域，避免不同工作区域内的设备、物品混用；每一个区域须有专用的仪器设备。5 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。5.1 PCR反应试剂如下：10PCR 扩增缓冲液，见附录A中A.1；2 U/L Taq DNA 聚合酶；10 mmol/L dNTPs；灭菌 ddH2O。5.2 DNA提取试剂盒或 DNA抽提试剂如下：DB22/T 26282017 2 TE 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，pH 8.0），见附录A中A.2；酚-氯仿-异戊醇（25/24/1 V/V）；异丙醇；70%乙醇。5.3 其他试剂 生理盐水；1 倍TAE 电泳缓冲液，见附录A中A.3；凝胶加样缓冲液，见附录A中A.4；10 mg/mL 溴化乙锭（EB），见附录A中A.5，或其他 DNA 染料替代品；1.5%琼脂糖凝胶，见附录 A.6；矿物油；DNA marker。5.4 阳性对照 鹅细小病毒DNA或含有VP3基因片段的质粒。5.5 阴性对照 灭菌ddH2O。5.6 引物 PCR引物浓度与序列，预计扩增片段375 bp，见表1。表1 特异性引物浓度及序列 引 物 引物序列 使用浓度 pmol/L 上游引物 下游引物 5-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-3 5-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3 20 6 仪器 6.1 普通 PCR 仪。6.2 低温高速离心机（12 000 g 以上）。6.3 电泳槽。6.4 电泳仪。6.5 紫外线灯或紫外凝胶成像仪。6.6 可调微量移液器（200 L1000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。6.7 Eppendorf 管（1.5 mL、0.5 mL、0.2 mL）。6.8 枪头（200 L1000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。6.9 水浴箱（室温100）或微波炉。DB22/T 26282017 3 6.10 冰箱（4 和-20）。6.11 生物安全柜。6.12 电子天平（d=1 mg）。7 操作步骤 7.1 样品采集及保存 采取可疑病鹅或病死鹅的肝、脾等病料2 g，加1倍灭菌双蒸水研磨成匀浆，-20，10 min，70 反复冻融3次。将匀浆液5 000 g 离心30 min，取上清液作为检测样品，-20 保存备用。7.2 DNA模板的制备 使用试剂盒提取病毒DNA，或取0.5 mL样品放入1.5 mL Eppendorf管中，煮沸5 min，冰浴5 min后10 000 g离心10 min，取上清作为DNA模板，-20 保存备用。7.3 PCR 反应 7.3.1 反应体系 10PCR扩增缓冲液 4.0 L 10 mmol/L dNTPs 2.0 L 2 U/L Taq DNA聚合酶 0.5 L 20 pmol/L上游引物 1.0 L 20 pmol/L下游引物 1.0 L 待检样品DNA 5.0 L 灭菌ddH2O 26.5 L 采用40 L反应体系，在0.5 mL的Eppendorf管中依次加上述试剂，除待检样品DNA外，同时设立阳性、阴性对照。如PCR仪无热盖功能，取50 L矿物油覆盖在混合液上。7.3.2 反应条件 在PCR扩增仪中，启动热盖功能，按下述程序和条件进行DNA扩增：95 预变性5 min；94 变性30 s，54 退火30 s，72 延伸40 s，30个循环；72 延伸10 min。4 保存备用。7.4 电泳 7.4.1 制备 1.5%琼脂糖凝胶板，见附录 A.6。7.4.2 小心吸出每个样品反应产物 5 L，加2 L 加样缓冲液混合。将检测样品按编号加入到对应的1.5%琼脂凝胶板的加样孔中。7.4.3 同法加入阳性对照 PCR产物。7.4.4 同法加入阴性对照 PCR产物。7.4.5 加入DNA Marker。7.4.6 5 V/cm 电压，电泳30 min。7.4.7 取出凝胶板，在紫外线灯下观察；或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档，打印。7.4.8 同 DNA Marker 进行比较，判断 PCR 扩增产物片段大小。8 结果判定 DB22/T 26282017 4 同DNA Marke进行比较，阳性对照出现大小约375 bp扩增条带，阴性对照无此扩增带出现条件下：检测样品产生一条与阳性对照相等的大小扩增条带，检测结果为阳性。未见条带出现，检测结果为阴性。必要时进行测序鉴定。DB22/T 26282017 5 A A 附 录 A（规范性附录）溶液制备 A.1 10PCR扩增缓冲液 1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）10.00 mL 1 mol/L KC1 50.00 mL Nonidet P40 8.00 mL 1.5 mol/L MgCl2 1.00 mL ddH2O 定容至100.00 mL A.2 TE缓冲液 A.2.1 1.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)三羟甲基氨基甲烷（Tris）6.06 g ddH2O 40.00 mL 滴加浓HCl约2.1 mL调pH至8.0，加ddH2O定容至50 mL。A.2.2 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na22H2O)186.10 g 氢氧化钠 20.00 g ddH2O 定容至1 000.00 mL 在800 mL蒸馏水中加入186.10 g EDTA-Na22H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液pH值至8.0（约需20.00 g氢氧化钠颗粒），然后定容至1 000.00 mL。室温保存。A.2.3 1TE（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA，pH 8.0）1.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)10.00 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2.00 mL ddH2O 定容至1 000.00 mL A.3 TAE缓冲液 TAE缓冲液（50）三羟甲基氨基甲烷（Tris）242.00 g 冰乙酸 57.10 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）100.00 mL ddH2O 定容至1 000.00 mL（使用时，取TAE缓冲液（50）用ddH2O 50倍稀释即可）DB22/T 26282017 6 A.4 凝胶加样缓冲液 溴酚蓝0.2 g，加10 mL蒸馏水过夜溶解。50 g蔗糖加入50 mL ddH2O溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100 mL。A.5 10 mg/mL溴化乙锭 溴化乙锭（EB）0.10 g ddH2O 10.00 mL A.6 1.5%琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖 1.50 g TAE缓冲液 100.00 mL 将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分融化（注意用微波炉加热时不要沸出），待冷却至50左右时，加入10 mg/mL的溴化乙锭（EB）5 L或其替代品溶液，摇匀后，用于制备凝胶板。DB22/T 26282017 7 B B 附 录 B（资料性附录）参考基因序列 142 ccaagctac aacaaccaca tctacaaagc gattaccagt 181 ggaacctctc aagatgcaaa tgtccagtat gcaggataca gtaccccctg ggggtacttt 241 gatttcaacc gcttccactg ccacttctcc cctagagact ggcagagact tatcaacaac 301 cattggggaa tcagacccaa gtctcttaaa ttcaagatct tcaatgtcca agtcaaagaa 361 gtcacaacgc aggatcagac gaagaccatt gcaaacaatc tcacgtcaac aattcaagtc 421 tttacggatg acgagcatca actcccgtat gtcctgggct cggctacgga aggcaccatg 48 1 cc gcc gtt tc cg tcg gat gt cta tg ccc t g cc gc ag 51 6 _