ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3754 2019 动物产品 中马、驴、骡源性成 分的定性 检测方法 实 时荧光 PCR 法 Qualitative detection of horse,donkey and mule derived materials in feed and relative products Real-time PCR method 2019-12-05 发布 2020-01-05 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局发布 DB37/T 3754 2019 I 前 言 GB/T 1.1 2009 DB37/T 3754 2019 II 引 言 PCR DB37/T 3754 2019 1 动 物产品 中马、驴、骡源 性成分的 定性检 测方法 实时荧 光 PCR 法 1 范围 LOD100 mg/kg 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB/T 27403 SN/T 1193 3 术语和 定义 3.1 荧光定 量PCR技术 PCR PCR 3.2 Ct 值 3.3 已知来 源于 单一 动物 源性 成分的 样品 4 原理 TaqMan PCR creatine kinase muscle ckmDB37/T 3754 2019 2 DNA DNA PCR DNA PCR PCR PCR 5 仪器和 设备 5.1 0.01 g 5.2 10 L 20 L 100 L 1000 L 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 4-20 5.9 pH 5.10 5.11 PCR 6 试剂和 材料 6.1 GB/T 27403 SN/T 1193 6.2 GB/T 6682 DNA 6.3 Taqman 1 表1 检测用 引物 和 Taqman 探针-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-P:-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TRAMA-18SrRNA F:5-CCTGGTATGGAAACATTGGAATC-3 R:5-CTTGGAGAGCGAGCACAGC-3-FAM-CCGGAAACAAAGTGAG-MGBNFQ-ckm F:5-CCTGGTATGGAAACATCGGAATC-3 R:5-CTCGGAGAGCGAGCACAGC-3-FAM-CCCGACACAAAGTGAG-MGBNFQ-ckm Taqman-MGB DB37/T 3754 2019 3 6.4 CTAB 55 mmol/L CTAB 1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA 100 mmol/L Tris pH 8.0 121 20 min 6.5 TE 10 m mol/L Tris-HCl(pH 8.0)1 mmol/L EDTA(pH 8.0)6.6 K 20 mg/L 6.7 RNA 5 g/L 6.8 Tris 6.9 6.10 6.11 6.12 70%6.13 2 PCR Premix Ex Taq AceQ qPCR Probe Master Mix 7 样品制 备 DNA 8 检验步 骤 8.1 DNA 提取 0.2 g 0.3 g 2 mL 1 000 L CTAB 40 L K 65 30 min 10 min 12 000 g 10 min 1 mL 2 mL 500 L 25:24:1-12 000 g 12 min 12 000 g 10 min 65 DNA 5 L RNA 37 30 min 200 L 24:1-12 000 g 12 min 12 000 g 10 min 70%12 000 g 1 min 50 L TE DNA-20 DNA DNA FastPureTM Tissue DNA Isolation Mini Kit 8.2 DNA 浓 度及 纯度 的测 定 DNA 260 nm 280 nm A260 A280 DNA 1 C=AN50.(1)C DNA ng/L A 260 nm N 50 A260 1 DNA A260/A280 1.8 2.0 DNA PCR DB37/T 3754 2019 4 DNA PCR DNA 8.3 实时荧 光PCR 检测 8.3.1 实时荧 光PCR 反 应体 系 PCR 2 表2 实时荧 光PCR 反 应体 系 PCR F R P DNA ddH20 12.5 1 1 1 1 25 8.3.2 实时荧 光PCR 反 应参 数 95 5 min 95 5 s 60 30 s 45 8.3.3 实验对 照 DNA DNA DNA DNA 9 质量控 制 a)Ct 40.0 b)Ct 40.0 c)Ct 30.0 d)Ct 30.0 e)Ct 30.0 10 结果判 定及 表述 10.1 结果判 定 9 a)Ct 35.0 b)Ct 35.0 c)Ct 40.0 DB37/T 3754 2019 5 d)35.0 Ct 40.0 DNA DNA TE PCR PCR Ct 40.0 Ct 40.0 PCR DNA A 10.2 结果表 述 10.2.1 10.2.2 10.2.3 10.2.4 11 防污染 措施 GB/T 27403 DB37/T 3754 2019 6 A A 附 录 A（资料 性附 录）扩增产 物序 列 A.1 马ckm 基因 实时 荧光PCR 扩 增的DNA 序 列（93bp）F P 1 CCTGGTATGG AAACATTGGA ATCAGCGCCG GAAACAAAGT GAGCTCTCGG GACCTGACAG 61 GGGGTGCTAT TGGTGCTGTG CTCGCTCTCC AAG R A.2 驴ckm 基因 实时 荧光PCR 扩 增的DNA 序 列（93bp）F P 1 CCTGGTATGG AAACATCGGA ATCAGCGCCC GACACAAAGT GAGCTCTCGG GACCTGACAG 61 GGGGTGCTAT TGGTGCTGTG CTCGCTCTCC GAG R _