ICS 07.100 C 04 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 25662016 b型流感嗜血杆菌核酸检测 多重PCR法 Multiplex polymerase chain reaction method for the detection of Haemophilus 2016-12-09发布 2017-03-01实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 25662016 I 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：张炜煜、杨修军、王慧、刘桂华、赵薇、黄鑫、李可维。DB22/T 25662016 1 b 型流感嗜血杆菌核酸检测 多重 PCR法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法。本标准适用于b型流感嗜血杆菌核酸的实验室检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。3.1 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 3.2 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸 3.3 dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸 3.4 dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸 3.5 dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸 3.6 dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸 3.7 dTTP：deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸 3.8 Bp：base pair，碱基对 4 试剂和材料 4.1 试剂 除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。4.1.1 水：应符合 GB/T 6682-2008 中一级水的规格 4.1.2 DNA 提取试剂：细菌基因组 DNA 提取试剂盒 4.1.3 10PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾，20 mmol/L 氯化镁。4.1.4 4 dNTP（10 mmol/L）：dATP、dCTP、dGTP、dTTP DB22/T 25662016 2 4.1.5 TaqDNA 聚合酶 4.1.6 分子量标记：100 bp2000 bp DNA 条带（DNA Ladder）4.1.7 10TAE 电泳缓冲液（储备液）：称取 484 g Tris，量取 114.2 mL 冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，溶于水中，定容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成 1TAE 电泳缓冲液（工作液）。4.1.8 琼脂糖：电泳纯 4.1.9 溴化乙锭 4.2 质控菌株 流感嗜血杆菌ATCC9795(b 型)、流感嗜血杆菌ATCC49247（N型）、流感嗜血杆菌ATCC10211(丢失荚膜的b 型)。流感嗜血杆菌ATCC9795(b 型)菌体DNA作为阳性对照。4.3 引物及探针 4.3.1 流感嗜血杆菌种属特异性引物：Hi-F：5-ACTTTTGGCGGTTACTCTGT-3 Hi-R：5-TGTGCCTAATTTACCAGCAT-3 4.3.2 流感嗜血杆菌荚膜特异性引物：Hi-af-F：5-CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC-3 Hi-af-R：5-TGTCCATGTCTTCAAAATGATG-3 4.3.3 b 型流感嗜血杆菌特异性引物：Hib-F：5-GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC-3 Hib-R：5-GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA-3 5 仪器和设备 5.1 PCR仪 5.2 生物安全柜 5.3 涡旋混合器 5.4 金属浴（或水浴锅）5.5 高压灭菌器 5.6 微量移液器：10 L、100 L、200 L、1000 L 5.7 静脉采血管 5.8 冷藏冷冻冰箱（2 8 和-20）5.9 恒流电泳仪（或毛细管电泳仪）5.10 高速离心机（13 000 rpm 以上）5.11 凝胶成像仪（或紫外透射台）6 试验步骤 6.1 样品 6.1.1 培养物 DB22/T 25662016 3 用接种环挑取培养基上疑似菌落，置于 200 L 无菌双蒸水中，振荡混匀形成悬浮菌液。6.1.2 血液 在儿童中，10%20%低菌量菌血症患者是由流感嗜血杆菌引起的。采集静脉血（3 mL5 mL）置于含有抗凝剂的采血管中，并标记。6.1.3 脑脊液 应由经验丰富的专业人员在无菌条件下操作。采集的脑脊液（要求1 mL）置于无菌、螺帽管中，并标记。6.1.4 咽拭子 将咽拭子绕过悬雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加35 滴无菌生理盐水的试管中，待检。6.2 细菌 DNA的提取 对于上述标本，各取0.1 mL加到一个0.2 mL无菌双蒸水中，振荡混匀，100 煮沸10 min，13 000 rpm/min离心10 min，吸取上清液即为DNA模版；使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。同时设阳性对照、阴性对照、空白对照，试剂对照。如不能及时检测，提取的DNA可置于-20 保存。6.3 PCR 扩增 6.3.1 引物：表1 引物序列 名称 引物序列 DNA片段（bp）Hi-F：5-ACTTTTGGCGGTTACTCTGT-3 流感嗜血杆菌种特异性引物 Hi-R：5-TGTGCCTAATTTACCAGCAT-3 273 Hi-af-F：5-CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC-3 流感嗜血杆菌荚膜特异性引物 Hi-af-R:5-TGTCCATGTCTTCAAAATGATG-3 343 Hib-F:5-GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC-3 b 型流感嗜血杆菌特异性引物 Hib-R:5-GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA-3 480 6.3.2 PCR 反应体系 25 L反应体系包括 10PCR缓冲液2.5 L，dNTP 2 L，1U Taq酶，10 pmol/L引物上下游各1 L，模板DNA 1 L，双蒸水补足25 L。6.3.3 PCR 扩增条件 94 预变性5 min；94 变性1 min，55 退火1 min，72 延伸1 min，共30个循环；72 延伸10 min，室温放置30 min。6.4 电泳及凝胶成像 秤取2.0 g琼脂糖加入100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化后加入适量的溴化乙锭（0.5 g/mL）,然后制成凝胶板。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5 L10 LPCR扩增产物分DB22/T 25662016 4 别和适量加样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。9 V/cm恒压下电泳30 min35 min。将电泳好的凝胶放到凝胶成像仪或紫外透射台上观察结果，进行判断并做好试验记录。7 结果判读 7.1 结果判定 若样品PCR扩增产物电泳出现273 bp（Hi基因片段）、343 bp（Hi-af基因片段）和480 bp（Hib基因片段）的任意一条扩增条带或三者均出现，同时阳性对照扩增产物电泳后出现目的条带（273 bp、343 bp和480 bp），阴性对照和空白对照扩增产物电泳后没有出现目的条带，判定结果为可疑阳性。PCR扩增产物电泳无目的扩增条带，且阳性对照扩增产物电泳后出现目的条带，阴性对照和空白对照扩增产物电泳后没有出现目的条带，判定结果为阴性。7.2 结果表述 如判定结果为阳性，则结果表述为“b型流感嗜血杆菌核酸检测 阳性”；如判定结果为阴性，则结果表述为“未检出b型流感嗜血杆菌核酸”。8 废弃物处理和防止污染的措施 8.1 检验过程中的废弃物需经 121 高压灭菌 30 min 后再弃置。8.2 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置，并按 GB 19489-2008 中的有关规定执行。8.3 检验过程中防止交叉污染的措施见 WS/T 230-2002 中污染的预防和控制措施。_