I C S 1 1.2 2 0B 4 1备 案 号：DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 7 9 5 2 0 1 2禽 流 感 病 毒 乳 胶 凝 集 检 测 方 法M e t h o d o f t h e l a t e x a g g l u t i n a t i o n f o r t h e d e t e c t i o n o f a v i a n i n f l u e n z a v i r u s2 0 1 2-0 1-0 6 发 布 2 0 1 2-0 3-0 1 实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 4 2/T 7 9 5 2 0 1 2I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 术 语 和 定 义.13 实 验 原 理.14 实 验 条 件.15 实 验 材 料.16 样 品 处 理.27 实 验 方 法.28 结 果 判 定.29 注 意 事 项.3附 录 A.4D B 4 2/T 7 9 5 2 0 1 2I I前 言本 标 准 按 G B/T 1.1-2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口。本 标 准 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院、武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司、湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心。本 标 准 起 草 人：金 梅 林、钟 广 汉、但 汉 并、郭 学 波、徐 高 原、张 安 定、周 艳 君、孙 小 美、李 淑 云。D B 4 2/T 7 9 5 2 0 1 2I I I引 言禽 流 感 病 毒（A v i a n I n f l u e n z a V i r u s,A I V）具 有 易 变 异 的 特 点，可 通 过 突 变 获 得 对 人 的 感 染 和 致 病能 力，导 致 重 大 的 公 共 卫 生 危 害。为 加 强 禽 流 感 监 测，制 定 了 禽 流 感 病 毒 乳 胶 凝 集 试 验 检 测 方 法，本 方 法 具 有 简 便、快 速 的 优 点，尤 其 适 合 基 层 现 场 使 用。本 文 件 的 发 布 机 构 提 请 注 意，声 明 符 合 本 文 件 时，可 能 涉 及 到 一 种 禽 流 感 病 毒 乳 胶 凝 集 检 测 试 剂盒 及 应 用（专 利 号：Z L 2 0 0 5 1 0 0 1 9 5 1 2.3）相 关 的 专 利 的 使 用。本 文 件 的 发 布 机 构 对 于 该 专 利 的 真 实 性、有 效 性 和 范 围 无 任 何 立 场。该 专 利 持 有 人 已 向 本 文 件 的 发 布 机 构 保 证，他 愿 意 同 任 何 申 请 人 在 合 理 且 无 歧 视 的 条 款 和 条 件 下，就 专 利 授 权 许 可 进 行 谈 判。该 专 利 持 有 人 的 声 明 已 在 本 文 件 的 发 布 机 构 备 案。相 关 信 息 可 以 通 过 以 下 联系 方 式 获 得：专 利 持 有 人 姓 名：金 梅 林、陈 剑 锋、喻 正 军、张 安 定、李 红 超、陈 焕 春。地 址：武 汉 市 洪 山 区 狮 子 山 街 1 号 华 中 农 业 大 学邮 政 编 码：4 3 0 0 7 0联 系 电 话：0 2 7-8 7 2 8 2 6 0 8传 真：0 2 7-8 7 2 8 2 6 0 8请 注 意 除 上 述 专 利 外，本 文 件 的 某 些 内 容 仍 可 能 涉 及 其 他 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些专 利 的 责 任。D B 4 2/T 7 9 5 2 0 1 21禽 流 感 病 毒 乳 胶 凝 集 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 禽 流 感 病 毒 的 乳 胶 凝 集 试 验 检 测 方 法 的 术 语 和 定 义、实 验 原 理、实 验 条 件、实 验 材 料、样 品 处 理、实 验 方 法、结 果 判 定 和 注 意 事 项 等。本 标 准 适 用 于 禽 类 咽/鼻 拭 子、肛 拭 子、内 脏 组 织、鸡 胚 尿 囊 液、细 胞 培 养 物 中 禽 流 感 病 毒 的 检 测。2 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。乳 胶（L a t e x）：聚 合 物 微 粒 分 散 于 水 中 形 成 的 胶 体 乳 液。3 实 验 原 理禽 流 感 病 毒 核 蛋 白 的 多 克 隆 抗 体 致 敏 固 相 载 体 羧 化 聚 苯 乙 烯 微 球，当 与 相 应 的 抗 原 反 应 时，可 形 成肉 眼 可 见 的 凝 集 颗 粒。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温（1 8 2 5）进 行。4.2 仪 器台 式 低 温 高 速 离 心 机、微 量 移 液 器、冰 箱、玻 片、吸 头。4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护。5 实 验 材 料5.1 乳 胶 诊 断 液5.2 阳 性 对 照含 禽 流 感 病 毒 的 鸡 胚 尿 囊 液 灭 活 处 理。5.3 阴 性 对 照未 接 种 禽 流 感 病 毒 的 鸡 胚 尿 囊 液。D B 4 2/T 7 9 5 2 0 1 225.4 样 品 处 理 液 A配 制 见 附 录 第 A.1 章5.5 样 品 处 理 液 B配 制 见 附 录 第 A.2 章6 样 品 处 理6.1 咽/鼻 拭 子 和 肛 拭 子用 无 菌 棉 拭 子 于 禽 的 咽 喉 或 鼻 腔、泄 殖 腔 中 沾 取 渗 出 液，然 后 浸 泡 于 1 m L 样 品 处 理 液 B 中，剧 烈震 荡 1 m i n 后 挤 出 棉 拭 子 中 的 液 体，冻 融 3 次 后 于 3 7 感 作 1 5 m i n，置 2 8，1 2,0 0 0 r/m i n 离心 5 m i n，取 上 清。6.2 内 脏 组 织剪 取 组 织 块 0.5 g，置 于 研 磨 器 中，加 样 品 处 理 液 A 1 m L，研 磨 后 取 出 组 织 浸 出 液，冻 融 3 次，然后 于 2 8，1 2,0 0 0 r/m i n 离 心 1 5 m i n，取 上 清。6.3 鸡 胚 尿 囊 液鸡 胚 尿 囊 液 样 品，1 2,0 0 0 r/m i n 离 心 5 m i n，取 上 清。6.4 细 胞 培 养 物细 胞 培 养 物 可 直 接 用 于 检 测 或 者 冻 融 一 次 后 检 测。7 实 验 方 法取 样 品、阳 性 对 照、阴 性 对 照 各 8 L 1 0 L，分 置 于 黑 色 背 景 的 玻 璃 片 上。各 加 等 量 的 乳 胶 试 剂，用 纤 细 洁 净 物（牙 签 等）搅 匀，使 液 面 直 径 达 到 1.5 c m 左 右，前 后 左 右 缓 慢 连 续 摇 动 3 0 s e c，并 在 1 m i n内 观 察 记 录 结 果。8 结 果 判 定8.1 凝 集 反 应 可 能 出 现 以 下 几 种 结 果：a）“+”全 部 胶 乳 凝 集，颗 粒 聚 于 液 滴 边 缘，液 体 完 全 透 明；b）“+”大 部 分 胶 乳 凝 集，颗 粒 明 显，液 体 稍 混 浊；c）“+”约 5 0 胶 乳 凝 集，但 颗 粒 较 细，液 体 较 混 浊；d）“”有 少 许 凝 集，液 体 呈 混 浊：e）“”液 滴 呈 原 有 的 均 匀 乳 状。8.2 成 立 条 件3 0 s e c 6 0 s e c 内 出 现 如 下 结 果，试 验 方 可 成 立：阳 性 对 照 样 品 与 乳 胶 诊 断 液 进 行 乳 胶 凝 集 反 应，应 出 现“+”以 上 凝 集；阴 性 对 照 样 品 与 乳 胶 诊 断 液 进 行 乳 胶 凝 集 反 应，应 不 凝 集。D B 4 2/T 7 9 5 2 0 1 238.3 结 果 判 断3 0 s e c 6 0 s e c 内 出 现“+”以 上 凝 集，判 为 阳 性；3 0 s e c 6 0 s e c 内 液 滴 呈 原 有 的 均 匀 乳 状 为 阴 性。9 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施，废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理。D B 4 2/T 7 9 5 2 0 1 24A A附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 制A.1 样 品 处 理 液 A四 硼 酸 钠（N a2B4O7 1 0 H2O）1 3.3 g硼 酸（H3B O3）1 6.0 8 g氯 化 钠（N a C l）8.5 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 8 0 0 m L，调 p H 值 至 8.4 后 定 容 至 1 0 0 0 m L。置 2 8 下 保 存 备 用。A.2 样 品 处 理 液 BN-乙 酰-L-半 胱 氨 酸 5 gN P-4 0 5 m L加 1 0 0 0 m L 经 1 2 1 高 压 蒸 汽 灭 菌 3 0 m i n 的 样 品 处 理 液 A。置 2 8 下 保 存 备 用。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _