ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 25152015 猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 检测方法 RT-PCR assay for porcine epidemic diarrhea virus 文稿版次选择 2015-11-10 发布 2015-12-10 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 25152015 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。本标准由安徽省农业标准化委员会归口。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：潘孝成、张丹俊、赵瑞宏、沈学怀、周学利、胡晓苗、戴银、侯宏艳、李贺侠、张宁、何国荣、周德权、王庆。DB34/T 25152015 1 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）RT-PCR 检测方法及其技术要求。本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中 PEDV 核酸的检测。2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction）RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）Taq 酶：Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus）PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（tris acetate-EDTA buffer）EB：溴化乙锭（ethidium bromide）3 原理 PEDV 是一种 RNA 病毒。RNA 反转录产生的 cDNA 可作为 PCR 模板进行扩增。根据 PEDV 保守基因序列设计一对引物，在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA。4 仪器 4.1 PCR仪扩增仪。4.2 台式低温高速离心机。4.3 电泳仪。4.4 凝胶成像系统。4.5 冰箱。4.6 微波炉。4.7 分析天平。DB34/T 25152015 2 4.8 水浴锅。4.9 微量移液器。5 试剂和材料 5.1 RNA 抽提试剂：Trizol。5.2 氯仿、异丙醇、乙醇。5.3 M-MLV 反转录酶。5.4 RNA 酶抑制剂。5.5 DEPC 处理的灭菌水。5.6 Taq DNA 聚合酶。5.7 dNTP。5.8 DL2000 DNA Marker。5.9 RT-PCR反应试剂。5.10 溴化乙锭（EB，10 g/L）或核酸染料。5.11 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2），见附录 A 中的 A.1。5.12 50TAE 电泳缓冲液，见附录A中的A.2。5.13 1琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。5.14 引物：上游引物 5-GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC-3，下游引物5-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3，引物浓度 10 pmol/L。5.15 阳性对照样品：PEDV 接种的 VERO 细胞培养物，阴性对照样品：正常 VERO 细胞培养物。6 操作步骤 6.1 样品的采集及处理 6.1.1 采样工具 15 mL 离心管、1.5 mL 离心管、剪刀、镊子和研钵，经 121（2），15 min 高压灭菌并烘干。6.1.2 肠内容物的采集与处理 采取病死或剖杀猪的小肠内容物，按 1:5 倍体积加入 PBS，研磨冻融 3 次，装入 15 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心 10 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中，-80保存备用。6.1.3 粪便的采集与前处理 取发病猪新鲜粪便，装入 15 mL 灭菌离心管中，按 1:5 倍体积加入 PBS，混匀，8000 rpm 离心 10 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中，-80保存备用。6.1.4 细胞培养物 细胞培养物冻融 3 次，转入 1.5 mL 离心管中，-80保存备用。6.2 RNA提取 DB34/T 25152015 3 6.2.1 用 Trizol 提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的 RNA。6.2.2 200 L 的样品和 800 L Trizol 置于一个 1.5 mL 离心管，反复颠倒混匀，室温静置 5 min。6.2.3 12000 g 4离心5 min，吸取上清移入新的离心管中，加入 200 L氯仿，用手剧烈振荡15 s，室温静置5 min。6.2.4 12000 g 4离心 15 min，吸取上层水相移入新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min。6.2.5 12000 g 4离心 10 min，小心弃去上清，加入 75乙醇 1 mL（DEPC水配制）。6.2.6 12000 g 4离心 5 min，弃去乙醇，室温干燥 25 min，加入适量 DEPC水，-80保存备用。6.3 反转录 6.3.1 在 PCR 反应管中依次加入：Oligo dT Primer 1 L，dNTPs(10 mM)1 L，实验样品 RNA 3 L，DEPC 水6 L。6.3.2 水浴锅或PCR仪中，65作用 5 min，冰上急冷 2 min。6.3.3 在上述反应管中再依次加入：5RT Buffer 4 L，RNase Inhibitor（40 U/L）0.5 L，M-MLV 反转录酶（200 U/L）1 L，DEPC水4.5 L。6.3.4 PCR 仪中，42作用 60 min，再 70作用 15 min，-20保存备用。6.4 PCR 6.4.1 PCR反应体系 10PCR Buffer 2.5 L，上游引物 1 L，下游引物 1 L，dNTPs(2.5 mml/L)2 L，Taq DNA 聚合酶 0.25 L，反转录产物 5 L，灭菌去离子水 13.25 L。6.4.2 PCR反应条件 94预变性 5 min 后；94 1 min，52 50 s，72 1 min，35 个循环；最后 72延伸 10 min。7 电泳 将 PCR 扩增产物 5 L与 2 L 上样缓冲液混合，点样于 1琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入 DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），缓冲液为 1TAE，以 5 V/cm 电压电泳 30 min 左右。8 结果判定 当阳性对照出现 663 bp 扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果成立。被检样品出现 663 bp 扩增条带为 PEDV 核酸阳性，未出现 663 bp 扩增条带的样品判为 PEDV 核酸阴性。图1 为一次检测结果图示。DB34/T 25152015 4 图中：M DL2000 Marker；1 阴性对照样品；2 阳性对照样品；3、4 阳性样品。图1 PCR 扩增电泳图 100bp-250bp-500bp-7 50bp-1000bp-2000bp-M 1 2 3 4 DB34/T 25152015 5 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 0.01 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1.1 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）71.6 g，先加适量灭菌去离子水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。A.1.2 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4H2O）27.6 g，先加适量灭菌去离子水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。A.1.3 量取 0.2 moL/L 磷酸氢二钠溶液 36 mL，0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液 14 mL，称取氯化钠 8.5 g，用灭菌去离子水溶解稀释至 1000 mL，4保存。A.2 电泳缓冲液（50 倍）A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0）二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.2.2 TAE 电泳缓冲液（50）羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8.0)100 mL 灭菌双蒸水 加至 1000 mL A.3 1琼脂糖凝胶 琼脂糖（电泳级）1 g 1TAE 电泳缓冲液 100 mL 微波炉中完全融化，降温至 60左右，加核酸染料 5 L，均匀铺板。_