ICS 65.150 B 52 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 13542013 罗非鱼无乳链球菌病双重PCR 诊断规程 Diagnostic protocols of tilapia infected with streptococcus agalactiae by duplex polymerase chain reaction 2013-08-01发布 2013-11-01实施 福建省质量技术监督局 发 布 DB35/T 13542013 I 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。本标准负责起草单位：福建省淡水水产研究所、顺昌县水产技术推广站。本标准主要起草人：樊海平、吴斌、张新艳、邓志武、郑磊、钟全福、曾占壮。DB35/T 13542013 1 罗非鱼无乳链球菌病双重PCR 诊断规程 1 范围 本标准规定了罗非鱼无乳链球菌病的术语和定义、流行情况与主要症状、样品采集与处理、双重PCR检测和诊断。本标准适用于罗非鱼无乳链球菌病的诊断、流行病学调查、检疫与监测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分：PCR检测法 3 术语和定义 下列术语与定义适用于本文件。3.1 罗非鱼无乳链球菌病 streptococcosis of tilapia infected by streptococcus agalactiae 罗非鱼受无乳链球菌感染，发生病理变化，出现行为异常或死亡。4 试剂与溶液 4.1 无乳链球菌16S rRNA基因部分序列引物：F1：5-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3，浓度10 mol/L，-20 保存；R1：5-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3，浓度10 mol/L，-20 保存。4.2 无乳链球菌sip(表面免疫相关蛋白)基因序列引物：F2：5-ATGAAAATGAATAAAAAGGTACTATTG-3，浓度10 mol/L，-20 保存；R2：5-TTATTTGTTAAATGATACGTGAACA-3，浓度10 mol/L，-20 保存。4.3 溶菌酶（100 g/mL）：生化试剂，-20 保存。4.4 蛋白酶K(100 g/mL)、NaCl（3 mol/L）、裂解缓冲液和SYBR Green工作液按附录A 的规定配制。4.5 DNA分子量标准（0.1 kb1.5 kb）：生化试剂，-20 保存。4.6 阳性对照：无乳链球菌标准株的DNA模板，-20 保存。4.7 阴性对照：已知无乳链球菌阴性的罗非鱼组织样品DNA模板，-20 保存。4.8 空白对照：无菌双蒸水为空白模板。DB35/T 13542013 2 4.9 除上述试剂与溶液外，其余按SC/T 7202.2-2007第 5 章的规定执行，实验室用水符合SC/T 7014-2006中第5章的规定。5 仪器与设备 5.1 PCR扩增仪:配备25 L和50 L的PCR反应底座。5.2 凝胶成像仪：可发射紫外线，携带摄影系统。5.3 电泳仪：输出直流电压0 V400 V，直流电流1 mA500 mA。5.4 水平电泳槽：容量250 mL650 mL，带凝胶板、样孔梳。5.5 台式离心机：配置1.5 mL转子，转速16 000 r/min以上。5.6 电动组织研磨器：转速500 r/min5 000 r/min。5.7 研磨棒：1.05 Kg/cm2、121.3 高压蒸气灭菌15 min。5.8 离心管：容量1.5 mL，1.05 Kg/cm2、121.3 高压蒸气灭菌15 min。5.9 PCR反应管：25 L和50 L，1.05 Kg/cm2、121.3 高压蒸气灭菌15 min。5.10 除上述仪器设备外，其余按SC/T 7202.2-2007第6章的规定执行。6 流行情况与主要症状 6.1 流行情况 该病流行于春、夏和秋季，高峰期为5 月9月，水温 25 37，传染性强，主要危害100 g以上的罗非鱼，也可感染体长1 cm3 cm的苗种。6.2 主要症状 患病罗非鱼摄食减少，游动迟缓，失去平衡，常在水上层侧游打转；眼球突出并伴随眼底出血和晶状体浑浊；鳃盖内侧发红、充血或出血；下颌、体侧、腹部以及各鳍条基部出血；肝脏、胆囊和脾脏肿大；肠黏膜充血；肠道和腹腔积液。7 样品采集与处理 7.1 采样 按 SC/T 7014-2006第6章的规定执行。7.2 样品封存、运输、登记与保存 按 SC/T 7103-2008第9章、第10章、第11章和第12章的规定执行。8 双重PCR检测 8.1 DNA模板的制备 8.1.1 DNA提取的环境 应符合SC/T 7014-2006附录B的规定，在样品区完成。8.1.2 样品准备 DB35/T 13542013 3 无菌解剖采集肾脏或脾脏组织 50 mg100 mg，放入 1.5 mL 离心管中，在无菌条件下，电动研磨器，3 000 r/min研磨至匀浆状。8.1.3 裂解 于研磨样品中加入溶菌酶50 L，37 裂解1 h；分别加入裂解缓冲液200 L和蛋白酶K 25 L，55 裂解1 h。8.1.4 DNA的提取 裂解样品 16 000 r/min 离心 10 min；取上清液于 1.5 mL 离心管中，加等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀 8 min，16 000 r/min 离心 10 min；取上层液体于 1.5 mL 离心管中，加 1/10 体积的 3 mol/L NaCl，2.5 体积的无水乙醇，颠倒混匀 5 min，-20 放置 30 min，16 000 r/min 离心 10 min；弃上清液，加入70乙醇500 L，重悬沉淀，16 000 r/min离心5 min；弃上清液，常温干燥10 min；加TE缓冲液30 L，制成DNA提取液，-20 保存备用。8.2 反应体系的准备 PCR反应可选择25 L、50 L反应体系进行。按表1的要求，加入除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物。按检测PCR反应体系的1 份/支或100份/支分装，-20 保存。在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加入相应体积的TaqDNA聚合酶和待测样品模板混匀，即为完全的反应预混物，按1份/支分装到0.2 mL PCR管中。表1 PCR 反应所需试剂组成 试剂 25 L 反应体系 50 L 反应体系 试剂终浓度 10PCR 缓冲液 2.5 L 5.0 L 1 氯化镁（25 mmol/L）3.0 L 6.0 L 3 mmol/L dNTP（10 mmol/L）1.0 L 2.0 L 200 mol/L 引物 F1（10 mol/L）0.5 L 1.0 L 0.08 mol/L 引物 R1（10 mol/L）0.5 L 1.0 L 0.08 mol/L 引物 F2（10 mol/L）1.0 L 2.0 L 0.32 mol/L 引物 R2（10 mol/L）1.0 L 2.0 L 0.32 mol/L 灭菌双蒸水 14.4 L 28.8 L TaqDNA 聚合酶（5 U/L）0.1 L 0.2 L 0.02 U/L 1 份反应总体积 25.0 L 50.0 L 100 份反应总体积 250.0 L 500.0 L 注：每25.0 L体系模板量1.0 L；每50.0 L体系模板量2.0 L。8.3 双重PCR扩增 8.3.1 按表1各反应体系所需的模板体积要求，在含有反应物的PCR管中分别加入相应体积的各样品DNA模板。并设阳性对照、阴性对照和空白对照。每个样品制备3个平行样。DB35/T 13542013 4 8.3.2 将含有反应物的 PCR 管置于 PCR 仪反应槽中，按以下程序进行扩增：94 预变性 5 min，（94 变性30 s，58 退火 30 s，72 延伸1.0 min）35个循环，72 延伸10 min，最后16 保温，准备进行产物的电泳。8.4 琼脂糖凝胶的制作 8.4.1 用1电泳缓冲液配制1的琼脂糖凝胶，加热至溶液完全透明。8.4.2 将凝胶液缓缓倒入放置好样孔梳的凝胶板，胶液厚度0.6 cm0.8 cm。样孔梳底部水平深入凝胶层0.3 cm0.5 cm，并距凝胶底部0.2 cm。8.4.3 待凝胶完全凝固后，拔掉样孔梳，即可用于电泳。8.5 电泳 8.5.1 将琼脂糖凝胶放入水平电泳槽，加样孔朝向负极，加入1电泳缓冲液没过胶面0.1 cm0.2 cm。8.5.2 10 L PCR扩增产物加入1.3 L SYBR Green工作液和 2 L 6载样缓冲液混匀，室温放置10 min后加到加样孔中。同时设一个泳道加入5 L DNA分子量标准物。8.5.3 盖上电泳槽后通电，在1 V/cm5 V/cm下电泳30 min，当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/22/3处时停止电泳，将凝胶置于凝胶成像仪上观察与拍照。8.6 分子量计算 按 SC/T 7202.2-2007中7.1.7的规定执行。8.7 结果判定 8.7.1 检测样品和阳性对照在121 bp和 1 305 bp处均有二条特定条带出现（参见附录B）；阴性对照在121 bp和1 305 bp处无条带出现或仅有一条特定条带出现；空白对照不出现任何条带；判定检测结果为阳性。8.7.2 阳性对照在121 bp和1 305 bp处均有二条特定条带出现；检测样品和阴性对照在121 bp和 1 305 bp处无特定条带出现，或仅有一条特定条带出现；空白对照不出现任何条带；判定检测结果为阴性。9 诊断 9.1 症状与7描述相符，双重PCR检测阳性，判定检测样品患罗非鱼无乳链球菌病。9.2 症状与7描述不相符，双重PCR检测阳性，判定检测样品为携带无乳链球菌。9.3 双重PCR检测阴性，判定检测样品为非罗非鱼无乳链球菌病。DB35/T 13542013 5 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 10 mg/mL蛋白酶K 蛋白酶K 10 mg 水 1 mL 溶解后分装于无菌离心管中（0.2 mL/管），-20 下保存。A.2 100 g/mL蛋白酶K 10 mg/mL蛋白酶K 100 L 水 10 mL 溶解后分装于无菌离心管中（0.5 mL/管），-20 保存。A.3 3 mol/L NaCl 氯化钠（NaCl）17.5 g 水 50 mL 磁力搅拌至完全溶解，加水定容至100 mL，室温保存。A.4 裂解缓冲液 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）2 mL 10SDS 10 mL 3 mol/L NaCl 3 mL 水 75 mL 混匀，室温保存。A.5 SYBR Green工作液 SYBR Green 10 L 1电泳缓冲液 990 L 混匀，2 8 保存，一个月内使用。B 混匀，28保存，一个月内使用。DB35/T 13542013 6 B C 附 录 B（资料性附录）罗非鱼无乳链球菌双重PCR检测电泳图 说明：1DNA Marker；2空白对照；3阳性对照；4阳性样品；5阴性对照 图B.1 罗非鱼无乳链球菌双重PCR检测电泳图 _ DB35/T 13542013 福 建 省 地 方 标 准 罗非鱼无乳链球菌病双重 PCR诊断规程 DB35/T 13542013*2013 年 9 月第一版 2013年 9 月第一次印刷