I C S 1 1.2 2 0B 4 1备 案 号：DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 2禽 流 感 病 毒 E L I S A 检 测 方 法E n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o b e n t t e s t f o r t h e d e t e c t i o n o f a v i a n i n f l u e n z a v i r u s2 0 1 2-0 1-0 6 发 布 2 0 1 2-0 3-0 1 实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 2I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 缩 略 词.13 实 验 原 理.14 实 验 条 件.15 实 验 材 料.16 样 品 处 理.27 实 验 方 法.28 结 果 判 定.39 注 意 事 项.3附 录 A.4D B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 2I I前 言本 标 准 按 G B/T 1.1-2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口。本 标 准 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院、武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司、湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心。本 标 准 主 要 起 草 人：金 梅 林、张 安 定、董 晓 辉、钟 广 汉、徐 高 原、陈 焕 春、郭 学 波、孙 小 美、李 淑 云、周 艳 君。D B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 2I I I引 言高 致 病 性 禽 流 感（H i g h l y P a t h o g e n i c A v i a n I n f l u e n z a,H P A I）是 严 重 威 胁 养 禽 业 发 展 的 烈 性 传 染 病，给 养 禽 业 造 成 了 巨 大 的 损 失。禽 流 感 病 毒 具 有 多 型、易 变 的 特 点。近 年 来 禽 流 感 病 毒（A v i a n I n f l u e n z aV i r u s,A I V）跨 越 了 中 间 宿 主 直 接 感 染 人 类，对 公 共 卫 生 安 全 的 威 胁 引 起 了 广 泛 的 关 注。本 标 准 规 定 了 禽 类 的 咽/鼻 拭 子、肛 拭 子、内 脏 组 织、鸡 胚 尿 囊 液、细 胞 培 养 物 中 禽 流 感 病 毒 的 E L I S A检 测 方 法。该 方 法 具 有 良 好 的 特 异 性 和 敏 感 性，准 确 度 高、重 复 性 好，适 用 于 临 床 大 量 样 品 的 快 速 检 测和 禽 流 感 诊 断。D B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 21禽 流 感 病 毒 E L I S A 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 禽 流 感 病 毒 E L I S A 检 测 方 法 的 缩 略 词、实 验 原 理、实 验 条 件、实 验 材 料、样 品 处 理、实 验 步 骤、结 果 判 定 和 注 意 事 项 等。本 标 准 适 用 于 禽 类 咽/鼻 拭 子、肛 拭 子、内 脏 组 织、鸡 胚 尿 囊 液、细 胞 培 养 物 中 禽 流 感 病 毒 的 检 测。2 缩 略 词下 列 缩 略 词 适 用 于 本 标 准。E L I S A(e n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y):酶 联 免 疫 吸 附 试 验O D 6 3 0 n m 值:6 3 0 纳 米 波 长 处 的 吸 光 值H R P:辣 根 过 氧 化 物 酶S:样 品 测 定 孔 O D 6 3 0 n m 值3 实 验 原 理本 方 法 使 用 抗 禽 流 感 病 毒 核 蛋 白 的 单 克 隆 抗 体 包 被 固 相 载 体 酶 标 板。加 入 供 试 样 品 后，如 果 样 品 中含 有 禽 流 感 病 毒 即 可 发 生 抗 原 抗 体 反 应，再 加 入 兔 抗 禽 流 感 病 毒 的 多 克 隆 抗 体，能 继 续 反 应 形 成 抗 原 抗体 复 合 物，并 和 相 应 的 酶 结 合 物 结 合，在 遇 到 相 应 的 底 物 时，复 合 物 中 的 酶 能 催 化 底 物 反 应 发 生 显 色。其 显 色 的 深 浅 与 相 应 的 抗 体 量 成 正 比，可 借 助 O D 6 3 0 n m 值 的 大 小 进 行 定 性 判 断。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温（1 8 2 5）进 行。4.2 仪 器台 式 低 温 高 速 离 心 机、微 量 移 液 器、冰 箱、恒 温 箱、酶 标 检 测 仪。4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护。5 实 验 材 料5.1 抗 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体。5.2 酶 标 板：9 6 孔 板，可 拆。5.3 兔 抗 禽 流 感 病 毒 的 多 克 隆 抗 体：由 灭 活 的 禽 流 感 病 毒 免 疫 家 兔 制 备。D B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 225.4 酶 结 合 物：H R P 标 记 的 羊 抗 兔 抗 体。5.5 阳 性 对 照：含 禽 流 感 病 毒 的 鸡 胚 尿 囊 液 灭 活 处 理。5.6 阴 性 对 照：未 接 种 禽 流 感 病 毒 的 鸡 胚 尿 囊 液。5.7 其 他 试 剂包 被 液、封 闭 液、洗 涤 液、样 品 处 理 液 A、样 品 处 理 液 B、底 物 液 A、底 物 液 B、终 止 液（见 附 录A）6 样 品 处 理6.1 咽/鼻 拭 子、肛 拭 子用 无 菌 棉 拭 子 于 禽 的 咽 喉 或 鼻 腔、泄 殖 腔 中 沾 取 渗 出 液，然 后 浸 泡 于 1 m L 样 品 处 理 液 B 中，涡 旋仪 震 荡 1 m i n 后 挤 出 棉 拭 子 中 的 液 体，冻 融 3 次 后 于 3 7 孵 育 1 5 m i n，1 2,0 0 0 r/m i n 离 心 5 m i n，取 上清。6.2 内 脏 组 织剪 取 组 织 块 约 1 g，置 于 匀 浆 器 中，加 入 1 m L 样 品 处 理 液 A 后 匀 浆，冻 融 3 次 后，置 于 3 7 下1 5 m i n，1 0,0 0 0 r/m i n 离 心 5 m i n，取 上 清。6.3 鸡 胚 尿 囊 液用 样 品 处 理 液 B 等 体 积 稀 释 后，置 于 3 7 1 5 m i n，每 隔 3 m i n 5 m i n 混 匀 1 次，1 0,0 0 0 r/m i n 离心 3 0 s e c 6 0 s e c，取 上 清。6.4 细 胞 培 养 物细 胞 培 养 物 可 直 接 用 于 检 测 或 者 冻 融 一 次 后 检 测。7 实 验 方 法7.1 抗 禽 流 感 病 毒 的 单 克 隆 抗 体 用 包 被 液 稀 释 到 工 作 浓 度（5 g/m L），加 入 酶 标 板，1 0 0 L/孔，3 7 孵 育 2 h。加 入 封 闭 液，2 0 0 L/孔，于 3 7 封 闭 2 h，取 出 酶 标 板 在 吸 水 纸 上 拍 干，于 2 8 保存 备 用。7.2 取 单 抗 包 被 板，先 用 洗 涤 液 洗 板 1 次，再 加 入 处 理 好 的 待 检 样 品，1 0 0 L/孔；加 入 阳 性 对 照 和 阴性 对 照 各 1 孔，1 0 0 L/孔，3 7 孵 育 3 0 m i n。7.3 取 出 单 抗 包 被 板 弃 去 孔 中 液 体，在 吸 水 纸 上 拍 干，用 洗 涤 液 洗 板 3 次，2 0 0 L/孔。每 次 静 置 3 m i n后 倒 掉 液 体，在 吸 水 纸 上 拍 干。7.4 将 兔 抗 禽 流 感 病 毒 的 多 克 隆 抗 体 稀 释 到 工 作 浓 度（1 0 g/m L），1 0 0 L/孔，3 7 孵 育 3 0 m i n。7.5 重 复 7.3 操 作 步 骤。7.6 加 入 酶 结 合 物，1 0 0 L/孔，3 7 孵 育 3 0 m i n。7.7 重 复 7.3 操 作 步 骤。7.8 加 入 底 物 液 A 和 底 物 液 B，各 5 0 L/孔，混 匀，置 室 温 下（1 8 2 5）避 光 显 色 1 0 m i n。7.9 加 入 终 止 液，5 0 L/孔，混 匀。7.1 0 用 酶 标 仪 测 定 各 孔 的 O D 6 3 0 n m 值，应 在 加 入 终 止 液 后 1 0 m i n 内 完 成。8 结 果 判 定D B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 238.1 E L I S A 试 验 成 立 的 条 件 为：阳 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 0.8；阴 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 0.2。8.2 如 果 S 0.3，判 为 阳 性；如 果 S 0.3，则 判 为 阴 性。9 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施，废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理。D B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 24A A附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 置A.1 包 被 液碳 酸 钠（N a 2 C O 3）1.5 9 g碳 酸 氢 钠（N a H C O 3）2.9 3 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L 即 可，置 2 8 保 存 备 用。A.2 封 闭 液5 g 脱 脂 乳 溶 于 1 0 0 m L 洗 涤 液。置 2 8 保 存 备 用。A.3 洗 涤 液氯 化 钠（N a C l）8 g氯 化 钾（K C l）0.2 g磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O）2.9 g磷 酸 二 氢 钾（K H 2 P O 4）0.2 gT w e e n-2 0 0.5 m L加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L 即 可，置 2 8 保 存 备 用。A.4 样 品 处 理 液 A四 硼 酸 钠（N a 2 B 4 O 7 1 0 H 2 O）1 3.3 g硼 酸（H 3 B O 3）1 6.0 8 g氯 化 钠（N a C l）8.5 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 8 0 0 m L，调 p H 值 至 8.4 后 定 容 至 1 0 0 0 m L，置 2 8 保 存 备 用。A.5 样 品 处 理 液 BN-乙 酰-L-半 胱 氨 酸 5 gN P-4 0 5 m L加 1 0 0 0 m L 经 1 2 1 高 压 蒸 汽 灭 菌 3 0 m i n 的 样 品 处 理 液 A，置 2 8 保 存 备 用。A.6 底 物 液 A磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4）1 4.6 g柠 檬 酸 9.3 3 g过 氧 化 氢 脲 0.5 2 gD B 4 2/T 7 9 1 2 0 1 25加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L，调 至 p H 值 至 5.0 5.4，置 2 8 保 存 备 用。A.7 底 物 液 B磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O）1 4.2 g柠 檬 酸 1 0.5 g联 苯 二 胺(T M B)1 0 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L，调 p H 值 至 5.0，置 2 8 避 光 保 存 备 用。A.8 终 止 液氢 氟 酸（H F）6.2 5 m L，加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L，置 2 8 保 存 备 用。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _