I C S 6 5.0 2 0.2 0B 2 1备 案 号：3 3 0 4 1-2 0 1 2DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 8 0 0 2 0 1 2两系杂交水稻 品种纯度 SSR 检测方法P r o c e d u r e f o r t e s t i n g s e e d p u r i t y o f t w o-l i n e s y s t e m h y b r i d r i c e b y S S R2 0 1 2-0 1-1 2 发 布 2 0 1 2-0 5-0 4 实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 4 2/T 8 0 0-2 0 1 2I目 次前 言.1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 原 理.25 核 心 引 物 确 定 原 则.26 检 测 程 序.27 结 果 计 算.3附 录 A（资 料 性 附 录）N Y/T 1 4 3 3-2 0 0 7 推 荐 的 2 4 对 S S R 引 物 序 列.4附 录 B（资 料 性 附 录）4 7 对 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 S S R 检 测 常 用 引 物 序 列.5附 录 C（规 范 性 附 录）相 关 试 剂 配 制.7D B 4 2/T 8 0 0-2 0 1 2I I前 言本 标 准 按 照 G B/T 1.1-2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 提 出 并 归 口。本 标 准 起 草 单 位：湖 北 省 种 子 管 理 局。本 标 准 主 要 起 草 人：周 正 明、谢 建 平、李 彧、高 明 鑫、马 磊。D B 4 2/T 8 0 0 2 0 1 21两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 S S R 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 S S R 检 测 技 术 方 法 的 术 语 和 定 义、原 理、核 心 引 物 确 定 原 则、检 测 程 序 和 结 果 计 算。本 标 准 适 用 于 品 种 真 实 性 已 经 确 认 的 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 的 鉴 定。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件，凡 是不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B/T 3 5 4 3.4-1 9 9 5 农 作 物 种 子 检 验 规 程 发 芽 试 验N Y/T 1 4 3 3-2 0 0 7 水 稻 品 种 鉴 定 D N A 指 纹 方 法3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准。3.1简 单 重 复 序 列 S S R s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s又 称 微 卫 星 序 列 或 串 联 重 复 序 列，是 由 1-5 个 核 苷 酸 为 重 复 单 位 聚 集 而 成 的 长 达 几 十 个 至 几 百 个 b p的 串 联 重 复 序 列。3.2聚 合 酶 链 式 反 应 P C R p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n一 种 用 于 在 体 外 扩 增 D N A 序 列 的 技 术 程 序。模 板 D N A 经 高 温 变 性 分 解 为 两 条 单 链，在 适 宜 温 度 下，经D N A 聚 合 酶 的 催 化 作 用，两 条 引 物 分 别 与 D N A 模 板 两 条 单 链 上 的 一 段 互 补 序 列 发 生 退 火 结 合，然 后 在 D N A聚 合 酶 的 催 化 下 以 四 种 脱 氧 核 苷 三 磷 酸（d N T P d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e）为 底 物，引 物 延伸 合 成 D N A。如 此 变 性 分 解、退 火 结 合 和 延 伸 合 成 D N A 反 复 循 环，使 位 于 引 物 序 列 之 间 的 D N A 片 段 呈 几 何倍 数 扩 增。3.3引 物 p r i m e r具 有 游 离 的 3-O H 末 端 及 特 定 序 列 的 寡 核 苷 酸 短 片 段，与 D N A 模 板 结 合 后 启 动 P C R 反 应。3.4亲 本 种 子 p a r e n t a lD B 4 2/T 8 0 0-2 0 1 22用 于 配 制 大 田 生 产 杂 交 种 子 的 不 育 系 和 恢 复 系 种 子。4 原 理简 单 重 复 序 列 分 布 于 水 稻 整 个 基 因 组，每 个 位 点 上 重 复 单 位 的 数 目 及 重 复 单 位 的 序 列 都 可 能 不 完 全相 同，因 而 造 成 了 对 应 座 位 上 的 多 态 性。由 于 每 个 简 单 重 复 序 列 两 端 的 序 列 是 高 度 保 守 的 单 拷 贝 序 列，因 而 可 根 据 其 两 端 的 序 列 设 计 一 对 特 异 引 物，利 用 P C R 技 术 进 行 扩 增，扩 增 产 物 利 用 电 泳 进 行 分 离，分析 其 长 度 多 态 性，达 到 区 别 不 同 于 杂 交 种 的 目 的。5 核 心 引 物 确 定 原 则在 水 稻 基 因 组 上 选 取 多 态 性、稳 定 性、重 复 性 等 综 合 特 性 好 的 引 物 作 为 核 心 引 物（推 荐 引 物 序 列 见附 录 A、附 录 B）。其 中 附 录 A 引 自 N Y/T 1 4 3 3-2 0 0 7 水 稻 品 种 鉴 定 D N A 指 纹 方 法，附 录 B 为 湖 北 省 现 有 两系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 S S R 检 测 常 用 引 物。6 检 测 程 序6.1 样 品 数从 供 检 样 品 中 随 机 取 4 0 0 粒 种 子 按 G B/T 3 5 4 3.4-1 9 9 5 农 作 物 种 子 检 验 规 程 发 芽 试 验 标 准 中 规 定的 方 法 进 行 发 芽，从 发 芽 的 幼 苗 中 随 机 取 1 9 2 株 幼 苗 进 行 检 测。同 时 将 标 准 的 杂 种 及 其 父、母 本 设 为 对照。注：为增加室内 S S R 检测结果与田间鉴定结果的一致性，可随机选取 1 9 2 株正常幼苗进行检测。6.2 D N A 提 取截 取 0.5 c m-1 c m 长 的 水 稻 幼 苗，加 入 4 0 l 1%N a O H 溶 液，在 沸 水 中 煮 3 0 s，然 后 加 入 6 0 l 2：1H C l-T r i s 溶 液，在 沸 水 中 煮 2 m i n，取 1 l 进 行 P C R 扩 增。6.3 特 定 引 物 筛 选利 用 亲 本 D N A，在 核 心 引 物 中 筛 选 出 具 有 较 好 多 态 性、亲 本 间 D N A 片 段 差 异 较 大，条 带 清 晰 的 引 物，作 为 特 定 引 物 对 供 检 样 品 进 行 检 测。引 物 的 选 用 还 应 考 虑 杂 交 种 的 生 产 情 况，注 意 以 下 原 则：a、对 亲 本 纯 度 较 高、去 杂 彻 底，且 制 种 田 隔 离 效 果 较 好 的，一 般 选 用 一 对 引 物 即 可。b、对 制 种 田 隔 离 条 件 较 差，有 外 源 花 粉 污 染 的，应 根 据 外 源 花 粉 类 型 增 加 引 物 对 原 模 板 D N A 进 行 再检 测。c、对 亲 本 中 杂 株 较 多，或 去 杂 不 严 的，应 根 据 亲 本 杂 株 类 型 增 加 引 物 对 原 模 板 D N A 进 行 再 检 测。6.4 P C R 扩 增6.4.1 反 应 体 系1 0 l 的 反 应 体 系 包 含 1 0 M 正 反 引 物 各 0.2 l，1 0 m M 的 d N T P 0.2 l，2 U/l 的 0.6 l A m p l i T a q G o l d D N A聚 合 酶，1 0 倍 P C R 反 应 液（1 0 0 m m o l/L T r i s-H C l，p H 8.3，1 5 m m o l/L M g C l 2，5 0 0 m m o l/L K C l，0.0 1%的明 胶）1 l，1 l 模 板 D N A（约 1 0 n g）和 6.8 l 超 纯 水。6.4.2 反 应 程 序D B 4 2/T 8 0 0 2 0 1 239 4 变 性 4 m i n，然 后 是 9 4 1 5 s、5 5 1 5 s、7 2 3 0 s 进 行 3 5 个 循 环，最 后 7 2 延 伸 5 m i n。注：此程序中5 5 1 5 s，其温度为参考温度，实际操作时可根据厂家提供的引物说明书设置。6.5 谱 带 分 离6.5.1 凝 胶 配 制称 取 4 g N u s i e v e 3:1 琼 脂 糖，加 入 9 6 m l 1 倍 T A E 缓 冲 液，室 温 下 放 置 3 0 m i n，在 微 波 炉 中 煮 沸 8 m i n，用 蒸 馏 水 加 至 原 来 体 积，待 冷 却 至 6 0 左 右 时，加 入 5 l 溴 化 乙 锭 溶 液 并 混 匀，倒 入 1 2 1 2 c m 的 制 胶盒 中，插 好 制 胶 梳，冷 却 后，缓 慢 抽 去 制 胶 梳，置 于 电 泳 槽 中，用 于 上 样。注：上样孔在电泳槽负极方向6.5.2 上 样用 移 液 器 依 次 取 约 1 0 l 扩 增 产 物，按 顺 序 点 于 上 样 孔。每 排 上 样 孔 分 别 点 1 0 0 b p 6 0 0 b p m a r k e r、父、母 亲 本 种 子 的 D N A 扩 增 产 物 作 为 对 照。6.5.3 电 泳、成 像将 上 样 的 琼 脂 糖 凝 胶 置 于 电 泳 槽 内，接 通 电 泳 仪 电 源，设 置 合 适 的 电 压 值，(一 般 为 6 V/c m-1 0 V/c m)，电 泳 约 3 0 m i n。电 泳 完 毕 后，取 出 凝 胶 置 于 保 鲜 膜 上，放 入 凝 胶 成 像 仪 中 观 察 并 拍 照。7 结 果 计 算以 亲 本 作 对 照，鉴 定 各 样 品 电 泳 谱 带 的 特 征 和 一 致 性，判 定 杂 株 类 型。其 带 型 与 母 本 一 致 的 定 为 不育 系 杂 株，其 他 与 杂 种 带 型 不 一 致 的 定 为 其 他 杂 株。然 后 按 下 列 公 式 计 算 纯 度 值 X.实 际 检 测 样 品 幼 苗 株 数-不 育 系 杂 株 数-其 他 杂 株 数X（%）=1 0 0实 际 检 测 样 品 幼 苗 株 数注：如使用多对引物进行检测，需对所用的每对引物分别给出计算结果，并说明引物筛选方法。AD B 4 2/T 8 0 0-2 0 1 24A B附 录 A（资 料 性 附 录）N Y/T 1 4 3 3-2 0 0 7 推 荐 的 2 4 对 S S R 引 物 序 列表 A.1 N Y/T 1 4 3 3-2 0 0 7 推 荐 的 2 4 对 S S R 引 物 序 列引 物 名 称 正 向 序 列(5-3)反 向 序 列(3-5)R M 2 9 7 T C T T T G G A G G C G A G C T G A G C G A A G G G T A C A T C T G C T T A GR M 7 1 C T A G A G G C G A A A A C G A G A T G G G G T G G G C G A G G T A A T A A T GR M 8 5 C C A A A G A T G A A A C C T G G A T T G G C A C A A G G T G A G C A G T C CR M 5 4 1 4 A C C A T G G T T C A A G A G T G A A A A C A G C T C A A C C T G T T G A G T GR M 2 7 4 C C T C G C T T A T G A G A G C T T C G C T T C T C C A T C A C T C C C A T G GR M 1 9 0 C T T T G T C T A T C T C A A G A C A C T T G C A G A T G T T C T T C C T G A T GR M 3 3 6 C T T A C A G A G A A A C G G C A T C G G C T G G T T T G T T T C A G G T T C GR M 7 2 C C G G C G A T A A A A C A A T G A G G C A T C G G T C C T A A C T A A G G GR M 2 1 9 C G T C G G A T G A T G T A A A G C C T C A T A T C G G C A T T C G C C T GR M 3 1 1 T G G T A G T A T A G G T A C T A A A C A T T C C T A T A C A C A T A C A A A C A T A CR M 2 0 9 A T A T G A G T T G C T G T C G T G C G C A A C T T G C A T C C T C C C C T C CR M 1 9 C A A A A A C A G A G C A G A T G A C C T C A A G A T G G A C G C C A A G AR M 1 1 9 5 A T G G A C C A C A A A C G A C C T T C C G A C T C C C T T G T T C T T C T G GR M 2 0 8 T C T G C A A G C C T T G T C T G A T G T A A G T C G A T C A T T G T G T G G A C CR M 2 3 2 C C G G T A T C C T T C G A T A T T G C C C G A C T T T T C C T C C T G A C GR M 2 7 3 G A A G C C G T C G T G A A G T T A C C G T T T C C T A C C T G A T C G C G A CR M 2 6 7 T G C A G A C A T A G A G A A G G A A G T G A G C A A C A G C A C A A C T T G A T GR M 2 5 3 T C C T T C A A G A G T G C A A A A C C G C A T T G T C A T G T C G A A G C CR M 1 8 T T C C C T C T C A T G A G C T C C A T G A G T G C C T G G C G C T G T A CR M 3 3 7 G T A G G A A A G G A A G G G C A G A G C G A T A G A T A G C T A G A T G T G G C CR M 2 5 8 T G C T G T A T G T A G C T C G C A C C T G G C C T T T A A A G C T G T C G CR M 2 7 8 G T A G T G A G C C T A A C A A T A A T C T C A A C T C A G C A T C T C T G T C CR M 2 2 4 A T C G A T C G A T C T T C A C G A G G T G C T A T A A A A G G C A T T C G G GR M 1 7 T G C C C T G T T A T T T T C T T C T C T C G G T G A T C C T T T C C C A T T T C AD B 4 2/T 8 0 0 2 0 1 25附 录 B（资 料 性 附 录）4 7 对 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 S S R 检 测 常 用 引 物 序 列表 B.1 4 7 对 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 S S R 检 测 常 用 引 物 序 列引 物 名 称 正 向 序 列(5-3)反 向 序 列(3-5)R M 2 1 2 C C A C T T T C A G C T A C T A C C A G C A C C C A T T T G T C T C T C A T T A T GR M 2 7 6 C T C A A C G T T G A C A C C T C G T G T C C T C C A T C G A G C A G T A T C AR M 2 4 2 G G C C A A C G T G T G T A T G T C T C T A T A T G C C A A G A C G G A T G G GR M 1 1 0 T C G A A G C C A T C C A C C A A C G A A G T C C G T A C G C C G A C G A G G T C G A GR M 2 8 6 G G C T T C A T C T T T G G C G A C C C G G A T T C A C G A G A T A A A C T CR M 2 6 3 C C C A G G C T A G C T C A T G A A C C G C T A C G T T T G A G C T A C C A C GO S R 2 8 A G C A G C T A T A G C T T A G C T G G A C T G C A C A T G A G C A G A G A C AR M 1 G C G A A A A C A C A A T G C A A A A A G C G T T G G T T G G A C C T G A CR M 2 3 4 A C A G T A T C C A A G G C C C T G G A C A G T A T C C A A G G C C C T G GR M 4 2 4 T T T G T G G C T C A C C A G T T G A G T G G C G C A T T C A T G T C A T CR M 2 4 3 G A T C T G C A G A C T G C A G T T G C A G C T G C A A C G A T G T T G T C CR M 2 6 4 G T T G C G T C C T A C T G C T A C T T C G A T C C G T G T C G A T G A T T A G CR M 2 1 A C A G T A T T C C G T A G G C A C G G G C T C C A T G A G G G T G G T A G A GR M 2 0 1 C T C G T T T A T T A C C T A C A G T A C C C T A C C T C C T T T C T A G A C C G A T AR M 2 0 2 C A G A T T G G A G A T G A A G T C C T C C C C A G C A A G C A T G T C A A T G T AR M 2 0 4 G T G A C T G A C T T G G T C A T A G G G G C T A G C C A T G C T C T C G T A C CR M 3 0 2 T C A T G T C A T C T A C C A T C A C A C A T G G A G A A G A T G G A A T A C T T G CR M 1 1 T C T C C T C T T C C C C C G A T C A T A G C G G G C G A G G C T T A GR M 2 4 7 T A G T G C C G A T C G A T G T A A C G C A T A T G G T T T T G A C A A A G C GR M 2 5 1 G A A T G G C A A T G G C G C T A G A T G C G G T T C A A G A T T C G A T CR M 1 6 4 T C T T G C C C G T C A C T G C A G A T A T C C G C A G C C C T A A T G C T A C A A T T C T T CR M 1 5 4 A C C C T C T C C G C C T C G C C T C C T C C T C C T C C T C C T G C G A C C G C T C CR M 3 4 1 C A A G A A A C C T C A A T C C G A G C C T C C T C C C G A T C C C A A T CR M 2 4 6 G A G C T C C A T C A G C C A T T C A G C T G A G T G C T G C T G C G A C TR M 3 1 0 C C A A A A C A T T T A A A A T A T C A T G G C T T G T T G G T C A T T A C C A T T CR M 2 6 G A G T C G A C G A G C G G C A G A C T G C G A G C G A C G G T A A C AR M 1 6 C G C T A G G G C A G C A T C T A A A A A C A C A G C A G G T A C G C G CR M 1 3 5 C T C T G T C T C C T C C C C C G C G T C G T C A G C T T C T G G C C G G C C T C C T CR M 1 3 6 G A G A G C T C A G C T G C T G C C T C T A G C G A G G A G C G C C A C G G T G T A C G C CR M 1 5 2 G A A A C C A C C A C A C C T C A C C G C C G T A G A C C T T C T T G A A G T A GR M 1 6 0 A G C T A G C A G C T A T A G C T T A G C T G G A G A T C G T C T C A T C G C C A T G C G A G G C C T CR M 1 8 6 T C C T C C A T C T C C T C C G C T C C C G G G G C G T G G T G G C C T T C T T C G T CR M 2 2 6 A G C T A A G G T C T G G G A G A A A C C A A G T A G G A T G G G G C A C A A G C T CR M 2 3 5 A G A A G C T A G G G C T A A C G A A C T C A C C T G G T C A G C C T C T T T CD B 4 2/T 8 0 0-2 0 1 26表 B.1 4 7 对 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 S S R 检 测 常 用 引 物 序 列(续)R M 2 8 7 T T C C C T G T T A A G A G A G A A A T C G T G T A T T T G G T G A A A G C A A CR M 3 4 0 G G T A A A T G G A C A A T C C T A T G G C G A C A A A T A T A A G G G C A G T G T G CR M 7 T T C G C C A T G A A G T C T C T C G C C T C C C A T C A T T T C G T T G T TR M 3 1 7 C A T A C T T A C C A G T T C A C C G C C C T G G A G A G T G T C A G C T A G T T G AR M 3 0 7 G T A C T A C C G A C C T A C C G T T C A C C T G C T A T G C A T G A A C T G C T CR M 4 8 0 G C T C A A G C A T T C T G C A G T T G G C G C T T C T G C T T A T T G G A A GR M 3 0 G G T T A G G C A T C G T C A C G G T C A C C T C A C C A C A C G A C A C GR M 3 A C A C T G T A G C G G C C A C T G C C T C C A C T G C T C C A C A T C T TR M 2 1 4 C T G A T G A T A G A A A C C T C T T C T C A A G A A C A G C T G A C T T C A C A AR M 2 4 8 T C C T T G T G A A A T C T G G T C C C G T A G C C T A G C A T G G T G C A T GR M 3 0 4 T C A A A C C G G C A C A T A T A A G A C G A T A G G G A G C T G A A G G A G A T GR M 2 7 1 T C A G A T C T A C A A T T C C A T C C T C G G T G A G A C C T A G A G A G C CR M 2 1 6 G C A T G G C C G A T G G T A A A G T G T A T A A A A C C A C A C G G C C AD B 4 2/T 8 0 0 2 0 1 27B C附 录 C（规 范 性 附 录）相 关 试 剂 配 制C.1 0.5 m o l/L T r i s-H C l 溶 液(P H 8.0)：称 取 6 0.5 克 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（T r i s），加 入 4 0 0 m l 双 蒸 水中 溶 解，加 入 浓 盐 酸 2 9.7 m l，加 水 定 溶 至 1 0 0 0 m l。C.2 2:1 H C l-T r i s 溶 液:0.2 5 m o l/L H C l 与 0.5 m o l/L T r i s-H C l(P H 8.0)按 2:1 配 制。C.3 0.5 m o l/L E D T A 溶 液（P H 8.0）：称 取 1 8 6.6 克 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠（N a2E D T A.2 H2O）,加 入 7 0 0 m l双 蒸 水 中 溶 解，加 入 2 0 克 N a O H，加 水 定 溶 至 1 0 0 0 m l。C.4 0.1 倍 T E 缓 冲 液：取 1 m l 1 m o l/L T r i s 溶 液(P H 8.0)和 0.2 m l 0.5 m o l/L E D T A 溶 液（P H 8.0），加 水 定 溶 至 1 0 0 0 m l。C.5 5 0 倍 的 T A E 电 极 缓 冲 液:称 取 2 4 2.2 克 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（T r i s），加 入 1 0 0 m l 0.5 M E D T A 溶液（P H 8.0）和 5 7.1 m l 冰 乙 酸，加 水 定 溶 至 1 0 0 0 m l。用 时 稀 释 5 0 倍。C.6 6 倍 上 样 缓 冲 液：0.2 5%的 溴 酚 兰，4 0%（W/V）蔗 糖。称 取 0.2 5 克 溴 酚 兰 和 4 0 克 蔗 糖，用 双 蒸水 定 容 至 1 0 0 m l。用 时 稀 释 6 倍。C.7 1 0 0 0 倍 溴 化 乙 锭 溶 液：称 取 5 0 m g 溴 化 乙 锭 定 溶 于 1 0 0 m l 双 蒸 水 中，配 成 0.5 m g/m l 的 1 0 0 0 倍 贮存 液，用 时 按 1：1 0 0 0 稀 释 配 制 染 色 液，溶 液 要 4 避 光 避 光（溴 化 乙 锭 是 一 种 诱 变 剂）。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _