ICS 65.020.01 B 16 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 28122017 水稻稻曲病菌 PCR快速筛查法 PCR Rapid Screening Method of Ustilaginoidea virens(Cook)Takahashi 文稿版次选择 2017-03-30发布 2017-04-30实施安徽省质量技术监督局发布 DB34/T 28122017 I 前言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院、安徽省农科院植物保护与农产品质量安全研究所。本标准主要起草人：陈雪娇、李云飞、宗凯、杨雪、孙娟娟、陈雨、郑海松、余晓峰、姚剑。DB34/T 28122017 1 水稻稻曲病菌PCR 快速筛查法 1 范围 本标准规定了水稻种子中稻曲病菌的PCR快速筛查法。本标准适用于水稻种子中稻曲病菌的快速筛查。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 基本信息 学名：水稻稻曲病菌。无性态为 Ustilaginoidea virens(Cook)Takahashi，子囊菌门（Ascomycota），粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），麦角菌科（Clavicipitaceae），绿核菌属（Ustilaginoidea）。有性态为稻麦角菌 Claviceps oryzae-sativae Has。别名：假黑穗病、绿黑穗病、青粉病等。传播途径：该菌以菌核和厚垣孢子的形式在病残体上或土壤中越冬，可随种子进行长距离传播。见附录A。4 方法和原理 本标准是通过洗涤法收集可能夹杂在稻种中的水稻稻曲病菌孢子及其 DNA，利用水稻稻曲病菌特异性引物对孢子释放的 DNA 进行 PCR 扩增，通过能否得到特异性条带判定稻种中是否带有水稻稻曲病菌。5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 往复式振荡器、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR 仪、凝胶成像系统、电泳仪、旋涡振荡器等。5.2 主要试剂 吐温 20，无菌去离子水，商品化 2PCR 反应预混夜，琼脂糖，TAE，Loading Buffer，EB。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合 GB/T 6682 的规定。6 鉴定方法 DB34/T 28122017 2 6.1 洗涤 将稻种混匀后称取 50 g 倒入经干热灭菌的 250 mL 三角烧瓶中，加入 100 mL 无菌去离子水和一至二滴表面活性剂吐温 20，用封口膜封口。将三角烧瓶放在往复式振荡器上振荡 10 min 后取下三角烧瓶，将悬浮液注入干热灭菌的 10 mL20 mL 刻度离心管内离心（4000 rpm/min）5 min。取出离心管，弃上清，再加剩余悬浮液，重复离心，直至所有悬浮液离心完毕，留沉淀物及少量上清液（总体积不超过 500 L）。弃上清过程中尽量动作轻柔，避免沉淀物悬浮。6.2 孢子裂解 将 6.1 中沉淀物及上清液悬浮混匀，连管一起置于沸水浴 15 min。冷却后备用。6.3 PCR 特异性检测 6.3.1 DNA模板 将 6.2 中制备的孢子裂解产物直接作为稻曲病菌 PCR 特异性检测的 DNA 模板。6.3.2 引物 针对水稻稻曲病菌与其他属种病菌 ITS 序列差异设计了一对特异性引物。uvr-F：5-CTTGTGTTTTCCAATGCATGT-3；uvr-R：5-CAAGTGCGAGGATAACTGAAT-3。引物由提供商品化服务的公司合成。该引物 PCR 扩增的特异性条带大小为 346bp。6.3.3 反应体系 用 uvr F 和 uvr R 对分离纯化的菌株 DNA 进行 PCR 反应，反应体积 50 L:2PCR 反应预混夜 25 L、10 M 引物各 2 L、模板(按照 6.3.1 制备)4 L，无菌去离子水补足至 50 L。将反应体系混匀后置于 PCR 仪中进行反应。以灭菌去离子水为空白对照，以水稻稻曲病菌 DNA 为阳性对照，以其他病菌 DNA 为阴性对照，每个样品重复 2 次。6.3.4 PCR 扩增条件 94 5 min；94 30 s，61 30 s，72 30 s，30个循环；72 5 min。反应结束后电泳分析 PCR 产物。7 结果判定 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下：待测样品扩增出 346 bp左右的条带，则判定为该样品水稻稻曲病菌 PCR 筛查结果为阳性。待测样品未扩增出 346 bp 左右的条带，则判定该样品水稻稻曲病菌 PCR筛查结果为阴性。8 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对水稻稻曲病菌 PCR 检测结果为阳性的样品应保存于 4冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌（121 15 min）后方可处理。DB34/T 28122017 3 A A 附 录 A（资料性附录）水稻稻曲病相关资料 A.1 分布地区 水稻稻曲病已广泛分布于世界水稻产区，其中以菲律宾、日本和印度发生最为严重。在国内主要分布于江苏、浙江、安徽、广东、广西、湖北、湖南、四川、北京、天津、黑龙江、辽宁、陕西等地。B A.1 分布地区 A.2 为害状 水稻稻曲病只发生在水稻穗部，为害部分谷粒。病菌侵入后，初期在颖壳外形成乳白色的薄膜包被的扁平球状，颖壳内部在解剖镜下可见白色菌丝，菌丝会在谷粒内胚外层形成白色的菌丝块，随着菌丝块逐渐膨大，内外颖裂开，露出淡黄色孢子座，然后包在内外颖两侧，不断增大，最后将花序包裹，形成了大于正常谷粒 34 倍的黄绿色至墨绿色的稻曲球（见图A.1），稻曲球外覆盖有一层银灰色薄膜，成熟后薄膜破裂，散出黄绿色的厚垣孢子粉末。老熟的稻曲球表面硬，子座龟裂绽开，外表形似松果。图A.1 水稻稻曲菌病为害状 稻曲球的切片观察（见图A.2）表明，菌丝与稻粒的胚乳层界限分明，大部分稻曲球中部有大块的发育良好的胚乳，并充满密集的淀粉粒。根据稻曲球中病菌发育程度的不同，从内到外可以分为 3 层：最里层浅黄色，由放射状生长的菌丝和正在形成的厚垣孢子组成；中间一层是橘黄色，由菌丝和孢子构成；最外层绿色至墨绿色，由成熟的孢子和老熟的菌丝组成。病粒上常有菌核存在，扁平状，表面黑色。菌核未常熟时在病粒内侧，成熟后外露，易脱落。一般 1 个病粒含有 1 个菌核，有的病粒含有 24个菌核。图A.2 稻曲球切面图 DB34/T 28122017 4 A.3 培养特征 该菌在培养基平板上生长速度较慢，26在 PDA 上日生长速率为 2 mm/d 左右。培养过程中最先在分离组织上产生肉眼可见的黄色或白色菌落（见图A.3），随着培养天数增加，菌落颜色不断加深变成黄绿色、深绿色至墨绿色，有时在菌落边缘还会形成比菌落颜色深的色素带。子座颜色为橄榄绿至墨绿色，成熟后表面龟裂成凹凸不平的形状。该病菌在稻曲球中和 PDA 培养基上均能产生厚垣孢子（培养 20 d 左右）（见图A.4），大小为 4.0 m7.8 m3.0 m7.0 m，圆形或略椭圆形，壁厚，黄至黑褐色，表面粗糙，具有瘤刺状凸起。图A.3 稻曲菌菌落形态（PDA 培养基 26培养 14d）图A.4 厚垣孢子（A）与薄壁分生孢子（B）薄壁分生孢子与子囊孢子较为少见。分生孢子无色，卵圆形或椭圆形，大小为 3.0 m7.0 m 4.0 m8.0 m，新生的分生孢子比老熟的分生孢子小，胞内基质均匀，成熟的分生孢子壁厚，胞内基质浓度增大，颜色变深。每个子囊壳中约有 300 个左右的圆柱状子囊，每个子囊中有 8 个线形子囊孢子。子囊孢子单胞无色，线状，易折断，大小为 52.0 m176.8 m0.52 m1.04 m，表面光滑无特殊结构。_