ICS 65.120 B 46 备案号：35988-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1697 2012 饲料中硝呋烯腙的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of Nitrofurfuryl olefinic hydrazone in feed Liquid chromatography with tandem-mass spectrometric method 2012-12-21发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1697 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院。本标准主要起草人：王庆峰、刘斌、石金娥、邴炜、华蕾、刘桂华、张庆波、郎乐、李滢倩。DB22/T 1697 2012 1 饲料中硝呋烯腙的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中硝呋烯腙含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用于浓缩饲料、配合饲料、预混料中硝呋烯腙的测定。本标准方法检出限为 2 g/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是 必不可少 的。凡 是 注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本适用于本文 件。凡 是 不注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 3 原理 试样 中的 目 标 化 合 物 用 乙腈-二甲基甲酰胺（60+40）溶 液提 取，经固 相 萃取柱净化后，液相色谱-质谱/质谱测定，外 标法定量。4 试剂与材料 除另有 规定 外，所有试剂均 为 分析纯，实 验用 水符 合 GB/T 6682的 一级水。4.1 乙腈：色谱 纯。4.2 甲醇。4.3 二甲基甲酰胺。4.4 硝呋烯腙标准品（CAS 编号:806-36-4）：纯度 98%。4.5 乙腈-二甲基甲酰胺（60+40）溶 液：取 40 mL二甲基甲酰胺，加入到 60 mL乙腈 中，混合 均匀。4.6 二甲基甲酰胺-甲醇-水溶 液：在 100 mL容 量 瓶 中 加入 2 mL二甲基甲酰胺 和 1 mL甲醇，用 水 定 容 到刻度。4.7 5%甲醇水溶 液：在 100 mL容 量 瓶 中 加入 5 mL甲醇，用 水稀释到刻度。4.8 5%二甲基甲酰胺 的 甲醇溶 液，在 100 mL容 量 瓶 中 加入 5 mL二甲基甲酰胺，用 甲醇 定 容到刻度。4.9 0.1%甲酸水溶 液：于 1000 mL容 量 瓶 中 加入 1 mL甲酸，用 水 定 容到刻度。4.10 流动 相：0.1%甲酸水溶 液+乙腈=68+32，取 320 mL色谱 纯乙腈，加入到 680 mL0.1%甲酸 水溶 液（4.10）中，混合 均匀，过 0.45 m有机 相 微孔滤膜。4.11 标准 储备 液（1.0 mg/mL）：准 确称取 100.0 mg硝呋烯腙（4.4），用 流动 相（4.11）溶解 定 容 至 100 mL。4.12 标准 工作 液 系 列：取 标准 储备 液（4.12）用 流动 相（4.11）稀释，配 制 浓 度依次 为：5 g/L、10 g/L、20 g/L、50 g/L、100 g/L。DB22/T 1697 2012 2 5 仪器和设备 5.1 液相色谱-质谱/质谱 仪：配 有电 喷雾（ESI）离子源。5.2 天平：感 量 0.0001 g。5.3 离心 机：10000 r/min。5.4 超声 波 水 浴。5.5 固 相 萃取 装置。5.6 氮吹 仪。5.7 涡旋 混合 仪。5.8 粉碎 机。5.9 试 验 筛：0.42 mm孔 径。5.10 固 相 萃取柱：聚 合 物固 相 萃取柱，50 mg/3 mL。6 试样制备 选 取有 代表性 饲料 样 品 至少 500 g，四 分 法缩 减 到 100 g，粉碎，全部通 过 0.42 mm试 验 筛，混 匀，装 入 密闭 容 器 中，避光保存，备 用。7 分析步骤 7.1 提取 称取 2 g试样（精 确到 0.001 g）于 50 mL离心管 中，加入 10.0 mL乙腈-二甲基甲酰胺（60+40）溶 液（4.6），超声 提 取 15 min，10000 r/min 离心 10 min，收集上清 液；残渣 中 加入 10.0 mL乙腈-二甲基 甲酰胺（60+40）溶 液（4.6）再 次 提 取，合并 两 次 上清 液。合并的 上清 液于 45 旋转蒸发 至 近干，用 3 mL二甲基甲酰胺-甲醇-水溶 液（4.7）溶解、涡旋 混合 后作 为 待 净化 液。7.2 净化 固 相 萃取柱 使 用 前 分 别 用 6 mL甲醇 和 6 mL水 进行活 化，将待 净化 液 以 不 超 过 1 mL/min的 速 度，过 已活 化 好 的 固 相 萃取柱（4.5），用 3 mL5%甲醇水溶 液（4.8）淋洗，弃去淋洗 液，将 固 相 萃取柱（4.5）抽干，用 5 mL5%二甲基甲酰胺 的 甲醇溶 液（4.9）洗脱，收集洗脱 液，用 氮气吹干，用 流动 相（4.11）定 容到 1 mL，离心 后取 上清 液，供 液相色谱-质谱/质谱测定。7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱 参考条 件 如 下：a)色谱 柱：C18填 料的液相色谱 柱；50 mm 2.1 mm，粒 度 1.8 m，或等效 柱；b)流动 相：0.1%甲酸水溶 液+乙腈=68+32（4.11）；c)进 样 量：5 L；d)柱 温：30；e)流 速：0.2 mL/min。7.3.2 质谱参考条件 DB22/T 1697 2012 3 质谱 参考条 件 如 下：a)离子源：电 喷雾（ESI）,负离子模式；b)离子喷雾 电 压：4 kV；c)雾 化 气：氮气，40 psi；d)干燥气：氮气，流 速：10 mL/min,温 度：330 e)扫描 方 式：多反 应检测（MRM）;f)监测 离子：母 离子 m/z 361.0，定量 子离子 m/z 221.9，定 性子离子 m/z 196.9；g)驻留时间：0.3 s；h)脱 溶剂 气、锥 孔 气 为 氮气，碰撞 气 为 高 纯 氮气；使 用 前 应 调节各 气 体 流 量 以使 质谱 灵敏 度 达 到 检测要 求；锥 孔电 压、碰撞能 量 等 电 压 值 应 优 化至最 优灵敏 度。7.3.3 空白试验 除不加试样外，均 按 上 述操 作 步骤 进行。7.3.4 液相色谱-质谱/质谱测定 7.3.4.1 定性测定 按照液相色谱-质谱/质谱 条 件测定 样 品和标准 工作溶 液，检测 目 标 化 合 物依 据 保 留时间 和 两 对 离子（特征 离子 对/定量 离子 对）所 对应的 LC-MS/MS色谱峰 面积 相对 丰 度 进行 定 性。要 求被 测 试样 中 目 标 化 合 物 的 保 留时间与 标准 溶 液中 目 标 化 合 物 的 保 留时间 一 致（一 致 的 条 件是 偏差小 于 20%），同时 要 求被 测 试样 中 目 标 化 合 物 的 两 对 离子 对应 LC-MS/MS色谱峰 面积比与 标准 溶 液中 目 标 化 合 物 的 面积比 一 致。相对 丰 度 偏差 不 超 过 表 1的规定，则 可 判断 样 品中 存 在 硝呋烯腙。表 1 定性离子对相对丰度的最大允许偏差 相对 离子 丰 度 50 20 至 50 10 至 20 10 允许 的相对 偏差 20 25 30 50 7.3.4.2 定量测定 以 标准 溶 液浓 度 对定量 离子 峰 面积绘 制 标准 曲线，待 测 样 液中硝呋烯腙的 响 应 值 应 在 标准 曲线线 性 范围内，超 过 线 性 范围 则应用 流动 相 稀释后 再进行 分析，外 标法定量。8 结果计算 测定 结果 可 由 仪 器 工作 站自 动 计算，或 按 公 式（1）计算 mV CX=.(1)式 中：X 样 品中硝呋烯腙的 总 量，单位为 微 克每千克（g/kg）；C 由标准 曲线计算得 试 液中硝呋烯腙的浓 度，单位为 微 克每升（g/L）；V 样 品定 容 体积，毫升（mL）；m 样 品 取样 质量，克（g）。计算结果 保 留 两 位 有 效 数字。DB22/T 1697 2012 4 9 回收率和精密度 9.1 回收率 本方法 在 5 g/kg-20 g/kg浓 度 范围内,用 空白阴 性 样 品 添 加 标准 溶 液 进行 校正,其 回 收 率范围 为70%-110%。9.2 精密度 9.2.1 重 复 性 在 重复 性条 件下 获得 的 两 次 独立 测定 结果 的 绝 对 差值 不 得 超 过 算 术 平 均 值 的 20%。9.2.2 再现 性 在 再 现 性条 件下 获得 的 两 次 独立 测定 结果 的 绝 对 差值 不 得 超 过 算 术 平 均 值 的 20%。DB22/T 1697 2012 5 A A 附 录 A（资 料性 附录）饲料中硝呋烯腙测定的相 关 色谱 图 和质谱 图 图 A.1 基 质 匹配加 标硝呋烯腙的样 品 MRM色谱 图（硝呋烯腙 添加浓 度 为 20 g/kg）图 A.2 硝呋烯腙 MRM质谱 图（硝呋烯腙 添加浓 度 为 20 g/kg）_