ICS 65.120 B 04 备案号：35744-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1613 2012 饲料中三聚氰胺含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of melamine residues in feeds HPLC-MS/MS method 2012-12-01发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1613 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、大成集团、嘉吉生化玉米工业有限公司、白城出入境检验检疫局、珲春出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡婷婷、姚天玲、王晓红、张丽、冯博、刘伟艳、张琦、李玲。DB22/T 1613 2012 1 饲料中三聚氰胺含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中三聚氰胺的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用于饲料及饲料原料中三聚氰胺的测定。2 规范性引用文件 下 列文件对 于本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用于本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所 有的 修改 单）适用于本 文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法。3 原理 试样 中 残留 的三聚氰胺用三 氯乙酸溶 液提 取，经混合型阳离子交换固 相 萃取柱净 化，用液相色谱-质谱/质谱 仪 测定，外 标法定 量。4 试剂与材料 除另 有 说明外，所 用 试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的 一级水。4.1 三 氯乙酸（C2HCl3O2）：优级纯。4.2 乙酸铵（CH3COONH4）：优级纯。4.3 乙酸铅（C4H6O4Pb.H2O）。4.4 甲醇（CH3OH）：色谱 纯。4.5 乙腈（CH3CN）：色谱 纯。4.6 氨水（NH4OH）。4.7 甲酸（CH2O2）：优级纯。4.8 1%三 氯乙酸溶 液：准 确称取 10 g三 氯乙酸（4.1）于 1 L容量瓶 中，用 水溶解 并定 容至刻度，混 匀后备 用。4.9 30%乙酸铅溶 液：称取 60 g乙酸铅（4.3），用 140 mL水溶解，混匀。4.10 5%氨 化 甲醇溶 液：准 确量取 5 mL氨水（4.6）和 95 mL甲醇，混匀后备 用。4.11 0.1%甲酸 的 水溶 液：准 确吸取 1 mL甲酸（4.7），用 水 定 容至 1 L，混合后备 用。4.12 10 mmol/L乙酸铵溶 液：准 确称取 0.772 g 乙酸铵（4.2），用 水溶解 并定 容至 1 L，混匀后备 用。DB22/T 1613 2012 2 4.13 标准 储备溶 液：准 确称取 三聚氰胺标准 物 质（CAS号：108-78-1，含量 99.0%）100 mg（精确 到 0.1 mg），用 甲醇溶解 并定 容 于 100 mL棕 色 容量瓶 中，配制 成 浓 度为 1000 g/mL的标准 储备 液。0 4 可 避光保存 6个月。4.14 标准工 作 液：准 确 移 取一 定 体积 的标准 储备溶 液（4.13），根据需 要用 基 质液 稀释 成三聚氰胺 浓度为 0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL、5.0 g/mL、10.0 g/mL、20.0 g/mL和 50.0 g/mL的 系 列 标准工 作 液。该 溶 液 须配制 于 棕 色 容量瓶 中，4-6条 件 下 保存。4.15 混合型阳离子交换固 相 萃取柱（MCX固 相 萃取柱）：60 mg/3 mL。使 用 前依次 用 3 mL甲醇、3 mL水 活 化。4.16 滤膜：0.22 m，有 机系。5 仪器 5.1 液相色谱-质谱/质谱 仪：配 备 电喷雾 离子 源（ESI）。5.2 组织捣碎机。5.3 高速 离 心 机：10 000 r/min。5.4 氮吹 仪。5.5 分析 天 平：感 量为 0.01 g和 0.0001 g。5.6 超声波清洗器：40 kHz。5.7 涡旋 混合 器。6 分析步骤 6.1 提取 称取 5 g（精确到 0.01g）粉碎 后 的 试样 置 于 50 mL离 心 管 中，加 人 25 mL三 氯乙酸溶 液（4.8），200 L乙酸铅溶 液（4.9），涡旋 混合 1 min，超声 提 取 10 min后，10 000 r/min离 心 5 min，取 上清 液 2.5 mL做待 净 化液。6.2 净化 将 6.1中的 待 净 化液 转移 至 活 化 后 的 MCX柱（4.15）中。依次 用 3 mL水 和 3 mL甲醇 洗涤，抽 至 近干 后 用 5 mL氨 化 甲醇溶 液（4.10）洗脱，整个 固 相 萃取 过程流速 不 超过 1 mL/min。洗脱 液于 50 下用 氮气吹 至 近干，残留物 用 1 mL甲醇 定 容，过 0.22 mm滤膜 后，供 LC-MS/MS测定。6.3 空白试验 除不称取试样外，均 按 6.1、6.2进行。6.4 测定 6.4.1 色谱参考条件 色谱 参考条 件 如 下：a)色谱 柱：强 阳离子交换 与反 相 C18混合 填 料，混合 比例（1：4），150 mm 2.0 mm，5 m；b)流动 相：10 mmol/L乙酸铵-乙腈溶 液（1+1），用 乙酸 调节 至 pH=3.0备 用；DB22/T 1613 2012 3 c)流速：0.3 mL/min；d)进 样量：5 mL。6.4.2 质谱参考条件 质谱 参考条 件 如 下：a)电 离 方 式：电喷雾电 离（ESI）；b)扫描 方 式：正 离子 扫描，多反 应 监 测（MRM）；c)电 离 电压：3 kV 5 kV；d)离子 源 温 度：300 550；e)脱 溶剂 气：0.75 MPa；f)雾 化 气：1.5 MPa；g)辅助 气：1.5 MPa；h)定 性 离子对、定 量离子对、去簇 电压、碰撞能 量 见表 1。表 1 三聚氰胺监测离子对、去簇电压和碰撞能量 化 合物 名 称 母 离子 m/z 子离子m/z 去簇 电压 V 碰撞能 量 V 85*55 27 三聚氰胺 127 68 55 40 注：加“*”的 为 定 量离子。6.4.3 定性分析 在同 一 色谱/质谱 条 件 下 进行 标准 溶 液和 样 品 溶 液的测定，如 果 样 品 溶 液中检出的色谱 峰 的 保 留 时间 与 标准 物 质色谱 峰 的 保 留 时间 一 致，所 选择 的 两 对子离子 的质 荷 比 也 一 致，而且 样 品 定 性 离子 的相 对 丰 度 与浓 度 相 当 标准工 作 溶 液的定 性 离子 的相 对 丰 度 相 比 较，相 对 标准 偏差 不 超过 表 2规定的 范围，则可 判 定 样 品 中 存 在 该 物 质。标准 溶 液 多反 应 监 测色谱 图 参 见附录 A。表 2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相 对离子 丰 度 50%20%至 50%10%至 20%10%允许 的相 对 偏差 20%25%30%50%6.4.4 定量测定 根据 试样 中 被 测 样 液中 被 测 组 分 的 含量 情况，选 取 响 应 值 相 近 的标准工 作 液 进行 分析，对 于 高浓 度 样 品 须 适 当 进行系 列 稀释。标准工 作 液和 样 液中 被 测 组 分 的 响 应 值 均应 在 仪 器 线性响 应 范围内。在 上 述色谱 条 件 下，三聚氰胺的 参考保 留 时间 为 8.91min，外 标法定 量。标准 溶 液的 多反 应 监 测色谱 图 参 见附 录 A。7 结 果计算 和表 述 用色谱 数 据 处理 机 或 按公 式（1）计算 试样 中三聚氰胺 残留含量，计算结果 需 扣 除 空 白 值。mV cX=.(1)式 中：X 试样 中 被 测 组 分残留量，单位 为 毫克每千克（mg/kg）；c 从 标准 曲线读 出的 被 测 组 分溶 液 浓 度，单位 为 微克每毫升（mg/mL）；DB22/T 1613 2012 4 V 样 液 最 终 定 容 体积，单位 为 毫升（mL）；m 样 液 所 代表 的 最 终 试样 的质 量，单位 为 克（g）；计算结果表示 到 小数点 后一 位。8 定量 限、回收率 和 精密 度 8.1 定量 限 本方法定 量 限 为 0.5 mg/kg。8.2 回收率及精密 度 在重复性 条 件 下 获得 的 两 次 独立 测 试 结果 的 绝 对 差值 不 大于 这两 个 测定 结果 的 算 术 平 均 值 的 15%。样 品 中三聚氰胺的 添 加浓 度 及 其 回收率、精 密 度实 验 数 据参 见附录 B。DB22/T 1613 2012 5 A A 附 录 A（资 料性 附录）三聚氰胺标准 品 液相色谱-质谱/质谱 图 图 A.1 三聚氰胺标准 品 液相色谱-质谱/质谱 图（0.5 mg/L）DB22/T 1613 2012 6 B B 附 录 B（资 料性 附录）不同添加水平平均回收率及精密 度 B.1 三聚氰胺 添加回收率 和 精密 度（n=10）_ 添 加浓 度 范围（0.5 5.0 mg/kg）样 品 回收率范围%相 对 标准 偏差%饲料 81.9 103.6 1.7 5.2