DB41 河南省地方标准 DB 41/T 8732013 樱桃无病 毒苗木繁 育技术规 范 Technical specification for propagatiom of virus-free seeding of cherry 2013-12-25 发布 2014-02-25 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 8732013 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由中 国农 业科 学院 郑州果 树研 究所 提出。本标准 由河 南省 林业 标准 化技术 委员 会归 口。本标准 起草 单位：中 国农 业科学 院郑 州果 树研 究所。本标准 主要 起草 人：赵改 荣、李 明、刘聪 利、黄贞 光、李 玉红。DB41/T 8732013 1 樱 桃无病 毒苗木繁 育技术 规范 本标准 规定 了樱 桃无 病毒 苗木繁 育技 术的 术语 和定 义、无 病毒 原种 圃和 母本 圃的建 立、无病 毒苗 木繁育、病毒 检测 及监 测、苗木出 圃。本标准 适用 于樱 桃无 病毒 苗木的 繁育。1 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本(包括 所有 的 修改单)适用于 本文 件。GB 5040 柑橘 苗木 产地检 疫规程 GB/T 12943 苹果 无病 毒母本树 和苗 木检 疫规 程 NY/T 328 苹果无 病毒 苗木繁育 规程 2 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 标准。2.1 樱桃无 病毒 苗木 不携带 李矮 缩病 毒(Prune dwarf virus,PDV)、李属坏 死环 斑病 毒(Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV)、樱桃 小果 病毒（Little cherry virus,LChV）、樱桃绿 环斑 驳病 毒（Cherry green ring mottle virus,CGRMV）、樱桃病 毒A(Cherry virus A,CVA)、樱桃坏死 锈斑 病毒(Cherry necrotic rusty mottle virus,CNRMV)、苹果 褪绿 叶斑 病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的 樱桃苗 木。2.2 樱桃无 病毒 原种 经有资 质的 专业 机构 检测，确定 不携 带本 标准 规定 病毒的 原始 植株。2.3 樱桃无 病毒 母本 圃 用于提 供樱 桃无 病毒 枝条、种子 等繁 殖材 料的圃地。3 无病毒 原种 圃的 建立 3.1 脱毒材 料母 株要 求 选取已 经进 入盛 果期，经 3 年以 上观 察，品种 纯正、生长健 壮、外观 无异 常的 植株作 为待 脱毒 材 料。3.2 脱毒 DB41/T 8732013 2 茎尖培 养脱 毒法 参见 附录 A，热处 理脱 毒法 参见 附录 B。待 脱毒 材料 可直 接 经过病 毒检 测，筛选 无 病毒材 料。3.3 无病毒 原种 的确 定 应经有 资质 的检 测机 构检 测认证，确 定不 带上 述7 种病毒 后，即可 作为 无病 毒原种 进行 保存。3.4 无病毒 原种 保存 原种保 存圃 与普 通果 园或 苗圃应 相 距 100 m 以上、搭建 300 目纱网 网室，封闭覆盖 全圃，出入口 设缓冲间。网 室内 土壤 隔离 覆盖。定植 在花 盆中，盆 内土壤 高温 消毒，每 个无 病毒品 种应 保存 3 株以上，每株编 号、挂牌 标识，绘 制定植 图。加强 肥水 管理，保证 树势 健壮。无病毒原种圃常用工具要专用，剪枝剪等修剪工具每株使用前用 70%酒精溶 液消毒。工作人员进入无病 毒原 种圃 前更 换工 作服。3.5 建立档 案 建立樱 桃无 病毒 原种 保存 圃档案。记 载品 种、砧木 的 中文名 称、外文 名称、品 系、株系；引 进单 位、来源、时间，脱 毒、病毒 检测的 单位、时 间及 每年 的观察 记录 等。4 无病毒 母本 圃建 立 4.1 无病毒 母本 圃圃 地选 择 母本圃 地应 选择 未曾 栽植 过果树 的地 块。全圃 封闭 覆盖 300 目纱网，与普通 果园或 苗圃 的距 离应 符合 NY/T 328 的规 定。4.2 无病毒 母本 圃设 计规 划 建圃前 按品 种采 穗圃、砧 木采种 圃和 无性 系砧 木圃 进行区 划。设计 好排 灌系 统、道 路、建筑 物等，并进行 土地 平整、土 壤改 良和土 壤消 毒。4.3 无病毒 母本 圃苗 木来 源 无病毒 母本 圃所 采用 的繁 殖材料 应全 部直 接来 自樱 桃无病 毒原 种保 存圃。准 确记载 品种、砧木、原母株株 系；脱毒、病 毒检 测的单 位、时间 等。4.4 无病毒 母本 圃定 植 无病毒 品种 采穗 圃和 砧木 采种圃 株行 距 为 1 m 2 m2 m 4 m；无性 系砧 木圃 株行距 为 0.5 m 1 m2 m 3 m。按品种 成 行栽植，同 一品 种栽 植在 一起，定植 后绘 制定 植图，做好标记，不 得混 杂。每株母 本树 都要 赋予 唯一 的编号。编号 由品 种名 称、原种圃 母株 株系 编号 和本株的 编号 共同 组成。按照编号给 每株 母本 树挂 牌。4.5 无病毒 母本 圃管 理 4.5.1 加强母 本圃 肥水 管理 和病 虫害防 治，保证 树势 健壮，无早 期落 叶现 象。4.5.2 无病毒 无性 系砧 木圃 的树 体，应 每年 短截 更新，其 方法与 普通 无性 系砧 木母 株相同。不 允许 在母本圃 嫁接。4.5.3 无病毒 母本 圃常 用工 具要 专用，剪枝 剪等 修剪 工具 每株使 用前 用70%酒精溶 液消毒。DB41/T 8732013 3 5 无病毒 苗木 繁育 5.1 苗圃建 立 5.1.1 苗圃地 选择 选择地 势平 坦，排灌 方便，土壤 肥沃，壤土、沙壤 土质，土壤 酸碱 度适 中，没有栽 植过 果树 及果 树苗木的 地方。苗 圃与 普通 果园、苗圃 的 距离 应符合 GB 5040 的规定，或 全圃 封闭覆 盖 100 目防虫 网、与普通 果园 及苗 圃距离应 符合 GB/T 12943 的规 定。5.1.2 苗圃规 划和 建设 苗圃应 划分 为若 干小 区。规划出 实生 苗播 种区、无 性系砧 木繁 殖区、成 苗培 养区等。按 规划 设计 出各级道 路、排灌 系统，并 统筹安 排。平整 土地，改 良土壤，土 壤消 毒及 增施 有机肥。5.2 实生砧 木苗 培育 砧木种 子应 采自 无病 毒母 本圃。采种 后标 记其 母株 编号，并即 刻沙 藏，秋季 或早春 播种。播 种前 施用杀菌 剂和 杀虫 剂，进行 土壤消 毒。播种 时按 照母 株编号 分别 播种，并 绘制 各株系 分布 图，田间 插牌标记，不 得混 杂。其他 管理 同普通 苗圃。5.3 无性系 砧木 苗培 育 5.3.1 材料来 源 无性系 砧木 繁殖 材料，应 来自无 病毒 母本 圃。繁 殖 材料应 分别 挂牌 标记 其母 株编号，按照 品种 及母株编号 分别 繁殖。绘 制各 品种及 株系 分布 图，田间 插牌标 记，不得 混杂。5.3.2 繁殖方 法 5.3.2.1 压条、分株 繁殖 法 从无病 毒母 本圃 植株 上直 接进行 压条、分 株繁 殖的 砧木自 根苗，在 苗圃 栽植 后再埋 干压 条繁 殖无 病毒砧木 苗。5.3.2.2 组织培 养法 组织培 养方 法繁 殖砧 木苗 木，继 代次 数不 超 过 7 代。5.3.2.3 扦插繁 殖法 用绿枝 扦插、硬 枝扦 插等 方法繁 殖无 病毒 砧木。5.4 嫁接 5.4.1 接穗采 集 接穗应 采自 无病 毒母 本圃。采集 接穗 的枝 条生 长健 壮、芽 体饱 满、无落 叶、无病害。采 集的 接穗 应在阴凉 处立 即剪 去叶 片。按品种 扎成 捆，挂牌 标记 母株编 号。接穗 存放 同普 通樱桃 接穗。5.4.2 嫁接 应分品 种及 不同 母株 分别 嫁接。采用 带木 质部 芽接 法嫁接，嫁 接位 置距 地 面 10 cm 20 cm 处。嫁DB41/T 8732013 4 接后应 按品 种及 母株 编号 分别记 载。补接 时，应与 原来嫁 接的 接穗 来源 相同。5.5 苗圃管 理 加强土 肥水 管理 与病 虫害 防治，保持 苗木 健壮 生长、无早 期落 叶现 象。6 病毒检 测及 监测 6.1 病毒检 测方 法 6.1.1 木本指 示植 物检 测法 李矮缩 病毒、李 属坏 死环 斑病毒、樱 桃小 果病 毒、樱桃绿 环斑 驳病 毒、樱桃 坏死锈 斑病 毒、苹果 褪绿叶斑 病毒 可以 采用 木本 指示植 物检 测法 进行 检测，操作 步骤 参见 附 录 C。6.1.2 酶联免 疫吸 附检 测法 能获得 抗血 清的 樱桃 病毒 可以采 用 A 蛋白 酶联免 疫 吸附法（PAS-ELISA）进 行检测，操 作步 骤参见附 录 D。6.1.3 反转录-聚合酶 链式 反应 检测法 李矮缩 病毒、李属 坏死 环斑病毒、樱桃 小果 病毒、樱桃绿 环斑 驳病 毒、樱桃病毒 A、樱桃坏 死锈 斑病毒、苹果褪 绿叶 斑病 毒 均可以 采用 反转 录-聚合 酶 链式反 应检 测法(RT-PCR)方法进 行检 测，操 作步 骤参见附 录 E。6.2 无病毒 原种 的监 测 无病毒 原种 圃的 每株 树，经常进 行田 间目 测（参见 附录 F），每年经 国家 有资 质的病 毒检 测单 位进行一次 病毒 检测，发 现携 带病毒 植株，应 连同 容器 立即清 除。6.3 无病毒 母本 圃的 监测 在生长 期，应每 月对 无病 毒母本 圃植 株的 表现 症状 进行全 面的 观察（参 见附 录 F），发现异常 立即检测。每 2 年对 每株 母本 树进行 一次 病毒 检测。发 现带毒 植株 立即 清除，并 进行局 部土 壤消 毒。6.4 无病毒 苗木 监测 7.4.1 每 年在 生长 季节 对 无病毒 苗木 进行 两次 全面 观察，发现 有病 毒症 状（参见附 录 F），立即 拔除带毒植 株及 相邻 植株。7.4.2 每年苗 木出 圃前，应进 行 1 次病毒 检测，1 抽 检，随机 取样。若 检测 出病毒，根 据编 号进 行追溯，对 其母本 树进 行检 测。若母本 树带 毒，应将 带毒母本 树繁 殖的 所有 苗木 及相邻 苗木 销毁 或按 普通 苗木处理；若 母本 树不 带毒，将携 带病 毒苗 木及 相邻 苗木销 毁，或按 普通 苗木 处理。7 苗木出 圃 7.1 苗木出 圃时 间 宜在苗 木停 止生 长、叶片 开始脱 落至 翌年 春季 萌芽 前出圃。土 壤上 冻时 不要 挖苗。7.2 苗木检 疫 DB41/T 8732013 5 挖苗前，应 到县、区 植物 检疫站 进行 检疫，并 办理 检疫证 书。7.3 挖苗 在挖苗 前一 天把 即将 落叶 的苗木 叶片 全部 抹除（带 叶栽植 除外）。苗木 主要 根系要 挖齐 全，尽量 减少根系 和苗 干受 伤。苗木 挖好后，应 及时 分级、扎 捆、挂 标签 和假 植。DB41/T 8732013 6 A 附 录 A（资料 性附 录）微茎尖 培养法脱 毒技 术 A.1 早春，从预选 的植 株上随机 切取 刚萌 动变 绿尚 未展叶 的饱 满芽，或 35 月剪取 抽生 的嫩 茎尖，去叶后作 为外 植体。A.2 用洗 涤剂 水浸 3 min 后，流水 冲洗 10 min，转入超净 工作 台上，70%酒精浸 泡 6 s，2%次氯酸 钠灭菌 10 min20 min，无 菌水冲 洗 3 次。A.3 解 剖镜 放置在 超净 台 上，用 棉球蘸 消毒 酒精擦 拭手及 台面，点燃 酒精灯，将大 小镊子 灼烧 消毒。将铺有 无菌 滤纸 的无 菌培 养皿放 置在 解剖 镜台 上，用镊子 取 出 A.1 切取的 材料，利用解 剖针 在解 剖镜 下剥除其 外部 叶原 基，切取 1.0 mm 以下茎尖分 生组 织(带 12 片叶原 基)，用无菌滤纸 吸干 水。A.4 将外 植体 接种 于接 种 培养基（表 A.1、表 A.2）上，25 恒温 培养，每 天光照 2000 lx3000 lx 14 h，黑暗 10 h，诱 导丛 生芽。表A.1 MS 培养 基配 方 单位为毫克/升 类型 成分 浓度 大量元素 硝酸钾 KNO3 1900 硝酸铵 NH4NO3 1650 磷酸二氢钾 KH2PO4 170 硫酸镁 MgSO47H2O 370 氯化钙 CaCl22H2O 440 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 Na2EDTA2H2O 37.3 硫酸亚铁 FeSO47H2O 27.8 微量元素 碘化钾 KI 0.83 硼酸 H3BO3 6.2 硫酸锰 MnSO44H2O 22.3 硫酸锌 ZnSO47H2O 8.6 钼酸钠 Na2MoO42H2O 0.25 硫酸铜 CuSO45H2O 0.025 氯化钴 CoCl26H2O 0.025 有机成分 肌醇 100 甘氨酸 2 盐酸硫胺素 VB1 0.1 盐酸吡哆醇 VB6 0.5 烟酸 0.5 其他 蔗糖 30000 水解乳蛋白 200 琼脂 6000 注：pH 值 5.8。DB41/T 8732013 7 表A.2 樱桃砧 木（ZY-1）培养 基 单位为毫克/升 种类 基本培养基 BA IBA NAA 接种培养基 MS 0.3 0.1-继代培养基 MS 0.4 0.4-生根培养基 1/2 MS(大量元素减半)-0.5 A.5 丛生 芽生 长到 1 cm 3 cm 高时，重复 A.3，切取 0.3 mm 以下茎 尖分 生组织，接 种在 接种 培养 基上进行 培养，诱导丛 生芽。A.6 将丛 生芽 或带 12 个芽的 茎端 转入 继代 培养 基上培 养，2 3 周后，取 苗高 2 cm 以上的 新梢 转移到生根 培养 基上，弱 光处 理 5 d 后，转 入光下 诱导 生根。A.7 将试 管苗 移栽 于温 室，成活 后检 测。DB41/T 8732013 8 A B 附 录 B（资料 性附 录）热处理 法脱 毒技 术 B.1 樱桃 品种 盆栽 苗脱 毒 将盆栽 苗放 入人 工气 候室，光照 强 度 10000 lx 以上，32 起始温 度下 预培 养 3 d 后，黑 暗温 度恒定 32，白昼 温度 每天 增加 1，达 到 37 时，保持 在白 昼 37 16 h/d、黑 暗 32 8 h/d、湿度 60%80%条件 下，变温热处 理 18 d。剪取新 梢顶部 0.5 cm 1.0 cm，嫁接 到无病 毒砧 木上，成活 后检测。B.2 樱桃 砧木 试管 苗脱 毒 选择继 代培 养 4 5 代增 殖 能力强 的无 性系，热 处理 方法参 见 B.1 变温 处理 18 d 后，剥 取 0.4 mm大小茎 尖进 行组 织培 养和 继代扩 繁，并进 行检 测。DB41/T 8732013 9 B C 附 录 C（资料 性附 录）木本指 示植 物温 室检 测法 C.1 早春 取无 病毒 砧木 苗，栽植 于直 径 15 cm、高 25 cm 的花 盆中，花 盆中 的基质经 过高 温消 毒，置于温室 内，温室 温度 白天 20 28，夜间 9 15。C.2 9 月份 或翌年 春季 砧 木发芽 期，从 待检 株上剪 取接穗，并对 待检 株进行 编号和 记录，写好 标牌，绑缚在 待检 接穗 上。C.3 从指 示植 物母 本树 上 剪取接 穗。C.4 采用 二重 芽接 法，先 把待检 接穗 的芽 片嫁 接在 砧木基 部，每株 嫁接 1 个 芽。同 时削 取指 示植 物的芽片嫁 接在 待检 芽的 上方，两芽 相 距 1.0 cm 2.0 cm。每个待检 样品 重复 嫁 接 4 盆5 盆，挂好 标牌。嫁接后，温 室温 度控 制在 18 26，同时 注意 防治害 虫和 控制萌蘖 生长。C.5 春季 苗木 发芽 前，在指示植 物接 芽的 上 方约 1.0 cm 1.5 cm 处剪砧。及 时除萌，保证 待检 芽和 指示植物 芽萌 发，并用 摘心 的方法 控制 待检 芽的 生长。C.6 从 5 月中 下旬 开始 至 9 月末，定期 观察 指示 植物的 症状 表现，做 好观 察记录，根 据指 示植 物的症状参照 表 C.1，鉴 定带 毒状 况。表C.1 六种樱 桃病 毒在 木本指 示植 物上 的主 要症 状 病毒种类 指示植物 主要症状 李矮缩病毒 白普贤、GF305、爱尔伯特（Elberta）、shirofugen、kwanzan 树势衰弱，簇叶、叶黄化、花叶、褪绿坏死环斑、叶细长、畸形 李属坏死环斑病毒 白普贤、GF305、shirofugen、kwanzan 坏死叶斑，脱落形成穿孔，流胶，接芽坏死 樱桃小果病毒 拉姆伯特（Lambert)、塞姆（Sam）、凯弥柯斯（cannidex）叶片边缘微卷，发病叶片在夏末和秋季变为红色或青铜色，果实着色不完全，斑点，个小，畸形 樱桃绿环斑驳病毒 白普贤、shirofugen、kwanzan 叶片黄化、次脉周围暗色斑驳 樱桃坏死锈斑病毒 塞姆（Sam）褐色坏死叶斑，锈状褪绿叶斑 苹果褪绿叶斑病毒 GF305、爱尔伯特（Elberta）叶片出现褪绿斑点，叶小，植株矮化，长势弱 DB41/T 8732013 10 C D 附 录 D（资料 性附 录）酶联免 疫吸 附法（ELISA）D.1 溶液 配制（均 用蒸 馏水）D.1.1 包被缓 冲液（pH9.6 100 m L）Na2CO3 0.159g NaHCO3 0.294g D.1.2 提取缓 冲液（0.05 mol/L pH 8.2 Tris-HCl 缓冲液 100 mL）0.2 m ol/L Tris 25mL 0.1 m ol/L HCl 22.5mL 蒸馏水 补足 100mL D.1.3 洗涤缓 冲液（PBST pH7.4 1000 m L）NaCl NaH2PO412H2O K2HPO4 KCl NaN3 Tween-20 D.1.4 抗原提 取缓 冲液 PBST+2%聚乙烯 吡咯 烷酮+0.2%卵蛋 白(或牛血 清蛋 白 BSA)D.1.5 底物缓 冲液（pH5.0 100 m L）柠檬酸 1.019 g NaH2PO412H2O 8.689 g D.1.6 酶底物 10 mL 底物缓冲 液+4mg 邻苯二胺 D.1.7 终止液（2 mol/L H2SO4 100 mL）36%浓硫酸 11.2 mL D.2 A 蛋白 酶联 免疫 吸附 法（PAS-ELISA）D.2.1 包被 A 蛋白：用包被缓 冲液 稀释 A 蛋白 纯品，检 测工 作浓 度为 1 g/mL 5 g/mL，酶联反应板每 孔 100 L，37 保温 2 h，倒 掉孔 中液 体后，用 PBST 洗板 34 次，每 次静 置 3 min 5 min。D.2.2 加第一 抗体：用 PBST 稀释抗 体至 工作 浓度，每孔 加 100 L，保温 和冲洗方 法同 D.2.1。8.0 g 2.9 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.5 mL DB41/T 8732013 11 D.2.3 加抗原 样品，取樱桃嫩叶 或一 年生 休眠 枝条 内皮层，每 克样 品加 入 5 mL 抗原提取液，研 磨后8000 r/min 离心 10 min，取上清液，每孔加 100 L，每样 品 2 孔，每 个微 孔板 需同时 设阳 性、阴性 和空白对照。4 冰箱过 夜，冲洗方 法同 D.2.1。第 一次 冲洗液 不得 溢出。D.2.4 加第二 抗体：用 PBST 稀释抗 体至 工作 浓度，每孔 加 100 L，保温 和冲洗方 法同 D.2.1。D.2.5 加酶标 A 蛋白：市 售辣根 过氧 化物 酶 标 A 蛋白用 PBST 稀释 至工 作浓 度，每 孔加 100 L，保温和冲洗 方法 同 D.2.1。D.2.6 加底物：每孔加 100 L，黑暗中 室温 放置 15 min 30 min 显色。D.2.7 终止反 应：每孔 加 25 L 2 mol/L H2SO4终 止反应。D.2.8 目测比 色后，用 酶标光度 计测 定读 数，波长 492 nm，OD 值大 于 2 倍阴性对 照值（即 P/N2）可判为 阳性。DB41/T 8732013 12 D E 附 录 E（资料 性附 录）反转录-聚合酶 链式 反应（RT-PCR）检测 法 E.1 十六 烷基 三甲 基溴 化铵(CTAB)溶液 配制 2%CTAB（W/V），4%PVP（W/V），100 mmolL-1 Tris-HCl（pH8.0），25 mmolL-1 EDTA（pH8.0），5 molL-1 NaCl，混 合灭 菌 121 15 min，灭 菌后 加入体积 分数 2%的 2-巯基乙 醇。E.2 CTAB 法提取 总 RNA E.2.1 取 100 mg200 mg 樱桃新鲜 嫩叶，研 钵中 加液氮 研磨 成粉 末状，迅 速转 入 1.5 mL Eppendorf管中，加入 600 L 的提取 缓冲液，混 匀，4，12000 r/min，离心 15 min。E.2.2 小 心吸 取上 清液，加入等 体积 的酚：氯仿：异戊醇(25：24：l)溶液，混匀，4，12000 r/min，离心 15 min。E.2.3 小 心吸 取上 清液，加入等 体积 的氯 仿：异戊 醇(24：l)溶液，混匀，4，12000 r/min，离心 10 min，重复 l 次2 次，以 蛋白层 不出 现为 止。E.2.4 取水相，加入 2.5 倍体积 的无 水乙 醇和 0.1 倍体积 的 3 mol/L NaAc(pH5.3)，混 匀，-20 放置 3 h，4，12000 r/min，离心 15 min。弃 去上 清液，用 70%无水 乙醇 洗涤，沉 淀 2 次。E.2.5 室温下 干燥 5 min 后，溶于 30L 50 L TE 或 DEPC 处理 纯水 中，-20 或-70 下保 存备 用。E.3 反转 录合 成 cDNA E.3.1 DNAaseI 消化 为了去 除 RNA 样 品中 可能 存在的 基因 组污 染，向离 心 管中加 入 0.5 L 1 L RRI（RNA 酶抑制 剂）、1 L DNAaseI、2 L 10DNAaseI Buffer 和 16 L RNA，用枪头 混匀 后 37 温浴 30 min，75 5 min，离心 2 min 后置 于冰 上冷 却。1.5%琼脂糖 胶检 测 RNA 质量，分光 光度 计检 测 RNA 浓度。E.3.2 反转录 取上 述 RNA 0.1 g5 g、0.2 g/L 随机六聚 体引 物（或特 异性 引物）1 L，加适 量 DEPC-dd H2O 至 12 L，70 温浴 5 min 后置 于冰 上冷 却，依次加 入 20 U/L RNA 酶抑 制剂 1 L、10 mmol/L dNTP 2 L、5反转录 缓冲 液 4 L，25 温 浴 5 min，加入 200 U/L 反转录 酶 1 L，42 温 浴 1 h，70 10 min，终止反应，离 心，-20 保存，即为 cDNA 模板，稀 释 8 倍后 用于 PCR 扩增。E.4 PCR 扩增 0.2 mL PCR 管中 依次 加入 下列成 分：cDNA 模板 2 L，病毒特异性 引物 及内 参 基因 RPII 正反向引物（10 M，引物 序列 参见 表 E.1）各 1 L，dNTPs（2.5 M）2 L，10PCR buffer 2 L，MgCl2（2.5 mmolL-1）1.6 L，Taq 酶（5UL-1）0.2 L，加 dd H2O 补足 20 L 体系。按照 以下 程序 进 行扩增：94 5 min；94 50 s，60（可 根 据引物 退火 温度 作适 当调 整）50 s，72 1 min，35 个循 环；72 10 min；4 保存 60 min。E.5 结果判 定 DB41/T 8732013 13 检测时 以阳 性植 株为 阳性 对照，无病毒 组培 苗及 dd H2O 为阴性 对照，以内参 基因 RPII 检验实验操作的准 确性。采 用 1.5%琼脂糖电 泳分 析 PCR 产物，观察到 与阳 性对 照相 同的 目的条 带的 样品 为阳 性，带毒性；与 阴性 对照 dd H2O 一 样，未观 察到 目的 条 带的样 品为 阴性，无 病毒；与阴 性对 照无 病毒 组培苗一样，观 察到 内参 基因 RPII 条带，但未 观察 到目的条 带 的样 品为 阴性，无 病毒。表E.1 七种病 毒及 内参 基因 RT-PCR 检测 特异 性引物序 列 病毒种类 引物 引物序列 片段长度 PNRSV PNRSV-F ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA 449 bp PNRSV-R TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG PDV PDV-F TAGTGCAGGTTAACCAAAAGGAT 172 bp PDV-R ATGGATGGGATGGATAAAATAGT LChV2 LChV2-F TCCGAATAGTCAGTTCAAAG 337 bp LChV2-R AATAGCCCTCATAAATCTCC CGRMV CGRMV-F CCTCATTCACATAGCTTAGGTTT 958 bp CGRMV-R ACTTTAGCTTCGCCCCGTG CNRSV CNRSV-F TCCCACCTCAAGTCCTAGCAG 584 bp CNRSV-R TGAACTTGGCCAGTTCTGCC ACLSV ACLSV-F TTCATGGAAAGACAGGGGCAA 309 bp ACLSV-R AAGTCTACAGGCTATTTATTATAAGTCTAA CVA CVA-F AGCCAGAAGGTATCATGCCAG 556 bp CVA-R ATGACATGCCTGCTGGGAG 内参基因 RPII RPII-F TGAAGCATACACCTATGATGATGAAG 195 bp RPII-R CTTTGACAGCACCAGTAGATTCC DB41/T 8732013 14 E F 附 录 F（资料 性附 录）病毒病 树体 表现 症状 F.1 李矮 缩病 毒（Prune dwarf virus,PDV）常见 的 危 害症状 可引起 樱桃 枝干 从上 向下 干枯，出现 簇叶、叶黄 化、花叶、叶细 长、畸 形等，病叶 也会 产生 褪绿 坏死环斑，有 时与 PNRSV 的症状 相似。F.2 李属 坏死 环斑 病毒（Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV）常见的 危害 症状 叶片上 出现 黄绿 色至 绿色 环斑、褪绿 斑、坏死 斑，环 斑内部 组织 坏死 脱落 形成 穿孔，孔洞 边缘 退绿并微微 突起。有 时产 生碎 叶、带 状叶、粗 花叶、耳 突等。F.3 樱桃 小果 病毒（Little cherry virus,LChV）常 见 的危害 症状 典型症 状有 叶片 边缘 轻微 卷曲，发病 叶片 在夏 末和 秋季变 为红 色或 青铜 色，侵染果 实会 使果 实不 能完全成 熟，着 色不 完全，产生斑 点，果 实小，畸 形，收 获时 期果 实只 有正 常果实 的 1/2 至 1/3 大小。受影响的 果实 呈现 暗红 色，三角状，口 味下 降，果实 成熟过 晚等 症状。F.4 樱桃 绿环 斑驳 病毒（Cherry green ring mottle virus,CGRMV）常 见的 危害 症状 感染酸 樱桃 导致 叶片 黄化、次脉 周围 暗色 斑驳 等症 状，在 甜樱 桃及 其他 李属 作物上 为潜 隐性 病毒，侵染后 通常 无症 状。F 5 樱桃 病毒 A(Cherry virus A,C VA)常见的 危害 症状 是典型 的潜 隐性 病毒，不 能直接 从植 物器 官的 为害 症状进 行识 别，与其 他病 毒混合 侵染 后会 加重 危害，严 重影 响产 量，叶片 畸形、细长 等。F 6 樱桃 坏死 锈斑 病毒(Cherry necrotic rusty mottle virus,CNRMV)常见 的危 害症状 叶 片出 现褐 色坏 死斑、锈状 褪绿 斑。F 7 苹果 褪绿 叶斑 病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)常见 的危 害症 状 为潜隐 性病 毒，被侵 染的 植株开 始无 明显 症状，2 年3 年后出现 叶片 褪绿、砧穗 嫁接 不 亲和、枝条稀疏、生长衰 退等 症状。夏季 环斑 处坏 死并 形成 穿孔，叶片 支离 破碎，直至脱落。某些品 种果 实缝合线处有 裂口，可 溶性 固形 物含量 降低，果 实品 质下 降。