ICS 67.120.30 B 50 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1978 2013 野鲤种质鉴定 微卫星法 Identification Specifications of Wild Carp Microsatellites Method 2013-12-18发布 2013-12-31实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1978 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省水利厅提出并归口。本标准起草单位：吉林省水产科学研究院。本标准主要起草人：郑伟、闫春梅、毛瑞鑫、陈伟强、王战蔚、王文兰、杜晓燕、李忠强、李秀颖、常淑芳、李永利。DB22/T 1978 2013 1 野鲤种质鉴定 微卫星法 1 范围 本标准规定了利用微卫星法进行野鲤种质鉴定技术的试验方法。本标准适用于鲜活野鲤种质鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可 少 的。凡 是 注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本适用于本文 件。凡 是不 注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用水规 格 和试验方法 3 术语和定义 下列术 语 和定 义 适用于本文件。3.1 微卫星 microsatelites 又称短串联重复序 列 或简 单 重复序 列（short tandem repeats，STRs；simple repeats，SSRs），以 2bp6bp的 短核苷酸序 列 为基 本单位，呈串联重复状散在分布 于 生物体基因组中。3.2 遗传距离 genetic distance 衡量群体间若干性状综合遗传差异大小 的 指 标。按 多元统计分析 方法 计算品 种 间多个性状基因型值 构成 的 多维空间 的 几何距离，就叫作群体间 的 遗传距离。主要的 遗传距离分析 方法 有：Nei 氏 标准 遗传距离（Neis standard genetic distance）。4 原理 微卫星由 核心序 列和 两侧 的 侧 翼 序 列 所构成，侧 翼 序 列 使 微卫星 特 异 地 定位于 染色 体 某一部 位，核心序 列 重复 数 的 差异 则 形 成 微卫星 高度 的 多 态 性。若 某 个体基因组中 某 个 微卫星 重复 单位 数相等，该 个体在 该座 位的 基因型为 纯 合 子，否 则 为 杂 合 子。检测 方法是 针 对微卫星 两 端 的 侧 翼 序 列 设 计引物，对 模 板 DNA进行 PCR扩增，根据结果判断 个体基因型，进行 统计分析。5 试剂 5.1 除非另 有 说明，所 用试 剂均 为分析 纯。实 验用水应 符 合 GB/T 6682 一级 水的要 求。DB22/T 1978 2013 2 5.2 无 水 乙醇。5.3 N,N,N,N 四甲 基 乙二胺（TEMED）：4 保存。5.4 Taq DNA聚 合 酶：-20 保存。5.5 分 子 量 标准(Markers)：DL 2000。5.6 溴化乙锭（EB）。5.7 琼脂糖。5.8 Tris饱 和 酚。5.9 300 g/L 丙烯酰胺溶液：20 mL水 中 融解 29 g丙烯酰胺，1 g甲叉双丙烯酰胺，定 容至 100 mL，4保存。5.10 5 Tris 硼 酸(5 TBE)电泳缓冲液：Tris 27 g，硼 酸 13.75 g，加蒸馏 水 400 mL溶解后，加入 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）10 mL，补充蒸馏 水定 容至 500 mL。5.11 100 g/L 过硫 酸 铵：8 mL水 中 溶解 1 g过硫 酸 铵，加 水 至 10 mL，4 保存，现 用 现配。5.12 1 g/L 硝 酸 银（AgNO3）染色液：将 AgNO3 0.5 g溶 于 超 纯 水 450 mL，加 ddH2O定 容至 500 mL，棕 色 瓶 中 保存。5.13 裂 解液：5 g/L十 二 烷 基 肌 胺 酸 钠，10 mmol/L EDTA（pH 8.0），200 g/mL蛋白 酶 K。5.14 显 色液：将 NaOH 10 g，无 水 Na2CO3 0.2 g，甲 醛 2 mL，溶解 于适 量 蒸馏 水 中，并定 容至 500 mL，现 用 现配。5.15 提 取 液：Tris饱 和 酚+氯仿+异 戊 醇（25+24+1，体 积比）。5.16 乙醇溶液：乙醇+水（7+3，体 积比）。5.17 dNTP：四 种 脱氧 核苷酸（4 dNTP）；保存 条 件 为-20 2。5.18 阳 性 对照 品：30尾 野鲤 DNA提 取 物，用 TE（pH 8.0）溶解至 50 ng/L，4 保存 备 用。5.19 阴 性 对照 品：30尾建 鲤 DNA提 取 物，用 TE（pH 8.0）溶解至 50 ng/L，4 保存 备 用。5.20 微卫星 引物：参见附录 A。6 仪器 6.1 电子 天平：精 度 0.0001 g。6.2 低温 高 速 离心 机：最大 容 量 30 1.5 ml，最 高 转速 15,300 rpm。6.3 单 道 可 调移 液 器：0.1-2.5 l，2-20 l，20-200 l，100-1000 l。6.4 水 浴恒温震荡器：温控范围 RT-100，控温精 度 1。6.5 紫外 分 光光 度 计：波长范围 190 nm-1100 nm，波长精 度 0.8 nm。6.6 PCR仪:控温范围 4.0-99.9。6.7 电泳 仪。6.8 凝胶 成 像 分析 系 统。7 取样 7.1 样本要求 用于试验的鲜活鲤 鱼样 本 数 量 至 少 30尾。7.2 试样制备 将 活 体中 直接采集 的 鳞片 或 鳍条样 品 浸泡 在 乙醇溶液 中，-20 保存 备 用。DB22/T 1978 2013 3 8 试验步骤 8.1 DNA提取 取 20 mg鳍条 加入 0.6 mL裂 解液，55 温育 1-2 h，并不 时轻摇 至 组 织块完全消 化，取上清 液 用提 取 液 抽 提 3次，加入无 水 乙醇 1 ml 于-20 过 夜沉淀，离心，弃去上清 液，再 用 0 预冷 的 乙醇溶液 洗 涤 1次，自 然 干 燥 后加 50-100 L 1 TE（pH 8.0）溶解 DNA，4 保存 备 用。8.2 DNA测定 8.2.1 DNA纯度测定 吸 取 1-3 L提 取 的 DNA，用 浓 度 10-20 g/L 琼脂糖 凝胶 100 V 电泳 30 min，检测 所 提 取 DNA的质 量。以 DNA条 带 的 分 子 量 及 有 无 拖 尾 为 标准 判断 DNA的质 量。分 别 于 260 nm波长 和 280 nm波长 下 测 定产 物（或 产 物 稀释 液）的 紫外 吸收 值。确 定 A260 A280比 值在 1.8-2.0范围 内，方可 正 常进行 后 续 实 验。8.2.2 DNA浓度测定 取 适 量 8.2.1测 定 后 产 物，于 260 nm波长 测 定 紫外 吸收 值，并 根据 公式(1)计算 产 物 DNA浓 度。稀释倍 数=LAX020.0260.(1)式 中：X 被 测 样 品 DNA浓 度,单位 为 微 克每毫升（g/mL）；A260 被 测 样 品在 260 nm检测 波长 下的 吸 光 度 值；L 比 色 池厚 度，单位 为 厘米（cm）；稀释倍 数 检测 前 DNA吸 光 度 值 达到允许 范围 0.1-0.8 时 所 需 要 稀释 的 倍 数。注：基因组 DNA完 成 定 量 测 试 后，稀释到 50 ng/L备 用。8.3 微卫星引物配制 取附录 A所 列 17种微卫星 引物 用水 配 制 成 浓 度 为 50pmol溶液，4 保存 备 用。8.4 PCR扩增 8.4.1 PCR反应体系 PCR反 应 体 积 均 为 15 mL，PCR反 应 体 系 组成 见 表 1。DB22/T 1978 2013 4 表 1 微卫星标记 PCR反应体系 试 剂 反 应 体 系 PCR Buffer(10)1.5 mL 正向 引物(2 pmol/mL)0.5 mL 反向 引物(2 pmol/mL)0.5 mL dNTPs(25 mmol/L)1.5 mL rTaq(5 U/mL)0.1 mL DNA(50 ng-100 ng)2 mL 超 纯 水 8.9 mL 8.4.2 PCR反应程序 PCR反 应 程 序 见 表 2。表 2 微卫星标记 PCR反应程序 阶 段 温 度 时 间 1 94 4 min 94 30 s 50 62 40 s 72 50 s 2 30个 循环 3 72 10 min 4 4 保存 8.5 PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶检测 8.5.1 制胶装置的准备 弹簧夹、干 胶 架、玻璃 胶 板 和 隔 板、塑料封 口 槽、鲨 鱼 齿梳 子、烧杯 和 搅棒。DB22/T 1978 2013 5 8.5.2 胶板的安装 用 去 污 剂溶液 洗涤 玻璃 板 和 间 隔 片，然 后 自 来 水 彻底 冲 洗，再 用 蒸馏 水 冲 洗 净。立放 于 一 旁晾 干，确 保 玻璃 板无 水 印。再将 两 片 玻璃 板（其中 一 片 带凹 口）左右 侧 边 用 间 隔 片 间 隔好，立 于 塑料封 口 槽里，用 弹簧夹 将 左右 两 边与 干 胶 架夹 在 一 起，将 配 好 的 琼脂糖 胶 液 倒 入 胶 版 下方的 塑料封 口 槽里，待 琼脂糖 胶 液 凝 固。8.5.3 制胶 将 配 制 的 52 mL 300 g/L 丙烯酰胺溶液 中 加入 40 mL 5 TBE和 107 mL 蒸馏 水，250 L 过硫 酸 铵，15 L TEMED，用 搅棒混匀 溶液（不 得 有 气 泡），将 制好 的 胶 板 斜放 45度 角，然 后 用 玻棒 引 流 缓缓 灌 入 上 述 胶 液。立即 在 胶 板 上 缘插 入 鲨 鱼 梳 子，梳 子 两 端 插 入 面 应 等 同，室 温，等 其 聚 合 完 毕 后，立即 使 用 或 保存 于 室 温 达 24 h。8.5.4 装胶 缓 慢 移去胶 板 底 端 的 塑料封 口 槽，将胶 板 带凹 口 面向内 装 到 电泳 槽 上，用 弹簧夹夹 紧 胶 模。用 1缓冲液 把 电泳 槽 的 上 下 槽 加 满，慢慢 地 从 凝胶上移 走 梳 子，用 注 射 器 冲 洗胶 的 顶 部。将 电 极 与 电泳 装置相 连，在 120 V 的 恒 定 电 压 下 预 电泳 20 min。8.5.5 点样 按照 扩增 产 物 的 量 等 比 例 加入 上样 缓冲液，吸 取 3 L混 合物 依 次 点 入 凝胶样 品 槽 中。当 所有 的 样 品 加 完 后，在 预 留 的 样 品 槽 点 入 DL2000 markers，将 电 源连 接，120 V 恒 压 电泳。8.5.6 凝胶的分离、标 识与固 定标 识操作 规程 当 指 示 剂 跑 到 胶 板 底 部 时，结 束 电泳，将 电 源 电 压 调 至 为“O”，再 关闭 电 源开关。取 下 凝胶 板，小心 去 掉 胶 板 两侧 的 隔 板后 在 蒸馏 水 中 轻轻 撬开 两 片 玻璃 板 取 下 凝胶，用 蒸馏 水 洗胶 30 s，再将凝胶 置 于1 g/L 硝 酸 银染色液 中 染色 10 min，倒 去 染色液，用 蒸馏 水 洗胶 1 min 后 将凝胶 置 于 显 色液 中 显 色 15 s，再 换 用 新 显 色液 显 色至 条 带 清 晰，取 出 凝胶 放 入蒸馏 水 中 停止 显 色。8.5.7 拍照 显 影 结 束 后，利用 凝胶 成 像系 统或 相 机将 聚丙烯酰胺 凝胶 拍 照 保存。8.6 对照 试验 分 别 取阴 性 对照 品、阳 性 对照 品 2ul，按 8.2 8.5步骤 进行试验。8.7 PCR数据统计 分 析 8.7.1 数据统计 选择 电泳后 清 晰 的 扩增 位 点 进行 数据 统计。根据 片 段 迁 移 位 置 的不 同，分 别 统计 出 每 个 样 品 的 基因 型（如 AA，AB，AC或 BB等），建 立 各 个群体 的 等 位 基因型 数据 阵 列。8.7.2 结果 分 析 利用 群体遗传 学 分析 软 件 专业（PopGene 3.2版 本），按照 共 显 性 二 倍 体 数据模 型，进行 遗传距离的 分析 和 计算，并用 UPGMA做 基 于 Neis遗传距离 的 树 形 图。DB22/T 1978 2013 6 9 鉴定 结果评价 对 形态 学 上 初步 判 定 为 野鲤的 样 本，根据 软 件 分析 结果 所 得 的 遗传距离 树 形 图，获 得 样 本 与 阴 性 对 照 组 和 阳 性 对照 组 的 遗传距离 判断 样 本的 亲 缘 关 系。与 阴 性 对照 Neis遗传距离 0.12，同 时 与 阳 性 对照 的 Neis遗传距离 0.05，就 判断该 样 本 为 野鲤。否 则 为 非 野鲤。DB22/T 1978 2013 7 A A 附 录 A（资料 性 附录）微卫星引物序 列 表 表 A.1 微卫星引物序 列 表 基因 座 locus 引物序 列 Primer sequence(53)重复序 列 Repetitive sequence 退火 温 度 Annealing temperature()P30 F:AAGTATTCGTCCTGTCGG R:GGCTCTTGGCTTGTTTAT(TA)24 53 P036 F:TAAATCAAGCACGCACAG R:CAGCGATCAACTCCATCT(CA)26 52 P044 F:GTACAGCGTGACAGCATT R:AAGTTCATCGGTGTCCTC(CA)14 53 P338 F:GAAGAATGGGTGAGTAAGA R:ACTAGGATTTGGAAGAGC(CA)41 51 P481 F:CGCAAACAGAAGGCAGAA R:CTCCAACCTCCAGGGCTA(CA)24 54 P456 F:GCTCGCTTCTGTAGGCACT R:GGAAGGCAGACGAAAGGT(CA)28 52 P483 F:AAAGCGTCTGGGACTAAA R:ACGGAAAATATCTGGAGAA(GT)14 52 P365 F:ACACTGGCTGCCTGCTCT R:TTCCCTCACAACCAACTTAC(GT)28 52 DB22/T 1978 2013 8 表 A.1（续）基因 座 locus 引物序 列 Primer sequence(53)重复序 列 Repetitive sequence 退火 温 度 Annealing temperature()P1202 F:ACGATCTTGGCTGGTTCTGT R:AGGGTGACAGACACGAGAGG(CT)11；(CA)29 58 P617 F:AGGTGACTAATGCTTGCGATAC R:AACCCTGTGAACCATCCATC(CA)14 53 P124 F:CCCTTCTGCCCATACTTC R:GGAGCCGAATGTCCTAAA(CA)22 52 P639 F:AATAGACCGAGGTCAAAC R:GAATACAAAGGCAGGAAG(CA)10 50 P159 F:AGTGCTGGAGAACAAGGC R:ATGGCTGATAAGACAGGAGA(CT)16 52 P372 F:TCTACTTCTACCGCCACT R:GACTATTCACCTGCATCTT(CA)22 54 P802 F:ACAGAGGGAATGGACAAA R:CTGAGGAAATGGAGGAAC(CA)9 53 P534 F:ACCGAGGTCAAACTACAC R:GAATACAAAGGCAGGAAG(CA)12 52 P1677 F:ACTCAGAGGCGAGAAAACCA R:TTCCCCCAGCCTTACTCTTT(GT)22 50 _