I C S 1 1.2 2 0B 4 1备 案 号：DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 7 8 9 2 0 1 2猪 链 球 菌 2 型 E L I S A 抗 体 检 测 方 法M e t h o d o f t h e e n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o b e n t a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f a t i b o d i e sa g a i n s t s w i n e s t r e p t o c o s u s s u i s s e r o t y p e 22 0 1 2-0 1-0 6 发 布 2 0 1 2-0 3-0 1 实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 4 2/T 7 8 9 2 0 1 1I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 缩 略 词.13 实 验 原 理.14 实 验 条 件.15 实 验 材 料.16 样 品 处 理.17 实 验 方 法.28 结 果 判 定.29 注 意 事 项.2附 录 A.3D B 4 2/T 7 8 9 2 0 1 1I I前 言本 标 准 按 G B/T 1.1-2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口。本 标 准 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院、武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司、湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心。本 标 准 主 要 起 草 人：金 梅 林、康 超、张 安 定、钟 广 汉、周 艳 君、董 晓 辉、陈 焕 春、徐 高 原、孙 小 美、李 淑 云、宋 念 华。D B 4 2/T 7 8 9 2 0 1 1I I I引 言猪 链 球 菌（S t r e p t o c o c c u s s u i s,S S）是 一 种 能 引 起 猪 发 病 的 重 要 致 病 菌，往 往 造 成 猪 群 感 染 和 大 量 死亡，同 时 严 重 危 害 人 类 健 康 甚 至 导 致 死 亡。根 据 荚 膜 多 糖 分 型，猪 链 球 菌 可 分 为 3 3 个 血 清 型，其 中 猪链 球 菌 2 型 是 毒 力 最 强、流 行 最 广 的 血 清 型。为 了 有 效 地 预 防 和 控 制 猪 链 球 菌 2 型 病，制 定 了 猪 链 球菌 2 型 E L I S A 抗 体 的 检 测 方 法，本 方 法 快 速、简 便，易 操 作，是 监 测 猪 2 型 链 球 菌 病 的 重 要 方 法。D B 4 2/T 7 8 9 2 0 1 11猪 链 球 菌 2 型 E L I S A 抗 体 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 猪 链 球 菌 2 型 E L I S A 抗 体 的 检 测 方 法 的 缩 略 词、实 验 原 理、实 验 条 件、实 验 材 料、样 品 处 理、实 验 方 法、结 果 判 定 和 注 意 事 项 等。本 标 准 适 用 于 检 测 猪 血 清 中 的 猪 链 球 菌 2 型 抗 体。2 缩 略 词下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。E L I S A（e n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y）：酶 联 免 疫 吸 附 试 验O D 6 3 0 n m 值：6 3 0 纳 米 波 长 处 的 吸 光 值3 实 验 原 理酶 联 免 疫 吸 附 试 验 是 将 抗 原 吸 附 在 固 相 载 体 上，加 入 待 检 抗 体，再 加 相 应 的 酶 标 记 抗 体，生 成 抗 原-待 测 抗 体-酶 标 记 抗 体 的 复 合 物，再 与 该 酶 的 底 物 反 应 生 成 有 色 产 物。借 助 分 光 光 度 计 的 光 吸 收 计 算 抗体 的 量。本 方 法 中 采 用 冷 酚 抽 提 法，提 取 并 纯 化 猪 链 球 2 型 菌 的 荚 膜 多 糖，以 其 作 为 包 被 抗 原，建 立 检测 猪 链 球 菌 2 型 抗 体 的 E L I S A 检 测 方 法。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温（1 8 2 5）进 行。4.2 仪 器抗 原 包 被 板、微 量 移 液 器、移 液 器 吸 头、酶 标 检 测 仪、恒 温 箱、冰 箱。4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护。5 实 验 材 料2 0 倍 浓 缩 洗 涤 液、样 品 稀 释 液、酶 标 记 抗 体、底 物 液 A、底 物 液 B、终 止 液、阳 性 对 照 血 清、阴性 对 照 血 清。配 方 见 附 录 A。6 样 品 处 理D B 4 2/T 7 8 9 2 0 1 126.1 样 品 采 集取 动 物 全 血，待 血 液 凝 固 后，4,0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n，收 集 上 清。要 求 血 清 清 亮，无 溶 血。6.2 洗 涤 液 配 制使 用 前，将 2 0 倍 浓 缩 洗 涤 液 恢 复 至 室 温（2 0 2 5），并 摇 动 使 沉 淀 溶 解（3 7 水 浴 锅 中 加热 5 m i n 1 0 m i n），然 后 用 蒸 馏 水 稀 释 2 0 倍，混 匀，稀 释 好 的 洗 涤 液 在 2 8 贮 存，7 d 内 使 用。6.3 样 品 和 对 照 血 清 稀 释处 理 后 的 样 品 按 1:4 0 的 比 例 稀 释；阳 性 和 阴 性 对 照 血 清 用 样 品 稀 释 液 按 1:4 0 稀 释。7 实 验 方 法7.1 取 抗 原 包 被 板，用 洗 涤 液 洗 板 1 次（2 0 0 L/孔）后 在 吸 水 纸 上 拍 干。7.2 加 入 稀 释 好 的 样 品，每 孔 1 0 0 L，同 时 设 阴、阳 性 对 照 孔，每 孔 1 0 0 L，置 3 7 作 用 3 0 m i n。7.3 弃 去 孔 中 的 溶 液，每 孔 加 入 稀 释 好 的 洗 涤 液 2 0 0 L，静 置 3 m i n 后，弃 去 洗 涤 液，并 在 吸 水 纸 上拍 干，重 复 洗 板 5 次。7.4 加 入 酶 标 记 抗 体，1 0 0 L/孔，置 3 7 作 用 3 0 m i n。7.5 弃 去 孔 中 的 溶 液，每 孔 加 入 稀 释 好 的 洗 涤 液 2 0 0 L，静 置 3 m i n 后，弃 去 洗 涤 液，并 在 吸 水 纸 上拍 干，重 复 洗 板 5 次。7.6 每 孔 加 底 物 液 A、底 物 液 B 各 5 0 L，混 匀，室 温 避 光 显 色 1 0 m i n。7.7 每 孔 加 入 终 止 液 5 0 L，混 匀 后 测 定 结 果。7.8 以 空 白 对 照 孔 调 零，用 酶 标 仪 测 定 各 孔 的 O D 6 3 0 n m 值。测 定 结 果 必 须 在 加 入 终 止 液 后 1 0 m i n 内 完成。8 结 果 判 定试 验 成 立 的 条 件 是 阳 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 0.8，阴 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 0.3。如 果 样 品 O D 6 3 0 n m 值 0.3 5，判 为 阳 性；如 果 样 品 O D 6 3 0 n m 值 0.3 5，判 为 阴 性。9 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施，废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理。D B 4 2/T 7 8 9 2 0 1 13A A附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 置A.1 样 品 稀 释 液 的 配 制脱 脂 乳 5 0 g氯 化 钠（N a C l）1 6 0 g氯 化 钾（K C l）4 g磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O）5 8 g磷 酸 二 氢 钾（k H 2 P O 4）4 gT w e e n-2 0 5 m L硫 柳 汞 钠 0.1 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L,经 0.2 2 m 滤 膜 过 滤 后，无 菌 分 装，5 0 m L/瓶。A.2 2 0 倍 浓 缩 洗 涤 液 的 配 制氯 化 钠（N a C l）1 6 0 g氯 化 钾（K C l）4 g磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O）5 8 g磷 酸 二 氢 钾（k H 2 P O 4）4 gT w e e n-2 0 5 m L加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L,经 0.2 2 m 滤 膜 过 滤 后，无 菌 分 装，5 0 m L/瓶。A.3 酶 标 记 抗 体 的 配 制酶 标 记 抗 体 0.2 m L氯 化 钠（N a C l）1 6 0 g氯 化 钾（K C l）4 g磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O）5 8 g磷 酸 二 氢 钾（k H 2 P O 4）4 gT w e e n-2 0 5 m L硫 柳 汞 钠 0.1 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L,经 0.2 2 m 滤 膜 过 滤 后，无 菌 分 装，2 0 m L/瓶。A.4 底 物 液 A 的 配 制磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4）1 4.6 g柠 檬 酸 9.3 3 g过 氧 化 氢 脲 0.5 2 gD B 4 2/T 7 8 9 2 0 1 14加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L，调 至 p H 值 至 5.0 5.4,经 0.2 2 m 滤 膜 过 滤 后，无 菌 分 装，1 2 m L/瓶。A.5 底 物 液 B 的 配 制无 水 乙 醇 1 0 m L联 苯 二 胺(T M B)2 0 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L，调 至 p H 值 至 5.0 5.4,经 0.2 2 m 滤 膜 过 滤 后，无 菌 分 装，1 2 m L/瓶。A.6 终 止 液 的 配 制氢 氟 酸（H F）6.2 5 m L，加 注 射 用 水 至 1 0 0 0 m L，经 0.2 2 m 滤 膜 过 滤 后，无 菌 分 装，1 2 m L/瓶。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _