ICS 01.040.67 X 04 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 25622015 大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法（ELISA）Determination of esterase activity in Daqu Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)文稿版次选择 2015-12-30 发布 2016-01-30 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 25622015 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、安徽农业大学。本标准主要起草人：周庆伍、李安军、蒋军、汤有宏、江昌俊、梁绍勋、李晓欢、何宏魁、吴文睿、刘国英、汪君、李红歌、马侠。DB34/T 25622015 1 大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法（ELISA）1 范围 本标准规定了大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法。本标准适用于大曲酯酶活力的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 酯酶活力单位 esterase activity unit 在 37、pH 6.0 条件下，15 min 水解-乙酸萘酯转化为-萘酚，每产生 1 nmol-萘酚为 1个酯酶 活力单位（U）。4 原理 试样中的酯酶与微孔中包被的羧酸酯酶抗体结合，在酶标记物的作用下，形成的酶标抗体抗原复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中酯酶活力。5 试剂和材料 5.1 本实验所用试剂除非另有说明，均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 二级水。5.2 酯酶试剂盒：28冰箱中保存。注：不同品牌的酯酶试剂盒其操作步骤可能有所不同，溶液配制和测试程序等可根据其试剂盒使用说明书略作调整。5.2.1 包被羧酸酯酶抗体的聚苯乙烯微量反应板。5.2.2 羧酸酯酶标准品：450 U/L。5.2.3 羧酸酯酶标记物。5.2.4 羧酸酯酶标准品稀释液。5.2.5 试样稀释液。5.2.6 洗板母液。DB34/T 25622015 2 5.2.7 显色剂A。5.2.8 显色剂B。5.2.9 反应终止液。5.3 磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）：优级纯。5.4 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）：优级纯。5.5 氯化钠（NaCl）：优级纯。5.6 磷酸盐缓冲溶液：pH=7.4。分别称取0.62 g 磷酸二氢钠(5.3)、5.73 g磷酸氢二钠(5.4)和9 g氯化钠(5.5)，加水溶解至1000 mL，在pH计上调节溶液 pH=7.4。5.7 羧酸酯酶标准溶液：根据酯酶试剂盒（5.2）的线性范围，用羧酸酯酶标准品稀释液（5.2.4）将羧酸酯酶标准品（5.2.2）稀释成不同活力的标准工作溶液，每次测定现配现用。5.8 洗涤液：将洗板母液（5.2.6）按照酯酶活力试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用。6 仪器和设备 6.1 酶标仪（配备450 nm滤光片）。6.2 分析天平：感量1 mg 6.3 冷冻离心机。6.4 振荡器。6.5 恒温培养箱。6.6 超声波细胞破碎仪。6.7 pH计。7 测定步骤 7.1 粗酶液制备 7.1.1 称取0.10.5 g试样，精确到0.001 g，置于100 mL烧杯中，加50 mL 磷酸盐缓冲溶液（5.6），振荡10 min。将烧杯置于超声波细胞破碎仪（6.6）中，超声探头直径 68 mm、超声温度 48、超声时间 35 s、间歇时间35 s、超声功率 300350 W、总超声时间 510 min，制成试样液。7.1.2 试样液于48、5000 r/min离心 10 min，取1 mL上清液于 250 mL 容量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液（5.6）至刻度，摇匀，制成粗酶液。保存过程中如有沉淀，应再次离心。7.2 测试程序 7.2.1 以下所有操作应在 2025室温下进行。7.2.2 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长450 nm。7.2.3 酯酶试剂盒（5.2）中所有的试剂的温度均应回升到室温（2025）后方可使用。7.2.4 洗板条件 7.2.4.1 人工洗板次数 5 次以上，每次注水量 250 L。7.2.4.2 自动洗板可以设定 5 个周期。7.2.5 记录空白、标准品和试样在微孔板上的位置。7.3 测定 DB34/T 25622015 3 7.3.1 吸取50 L羧酸酯酶标准工作溶液（5.7）依次加入标准溶液孔底部。吸取 40 L 试样稀释液（5.2.5）加入试样孔底部，再加10 L粗酶液（7.1），混合均匀。7.3.2 封板膜封板后置于37恒温培养箱（6.5）中孵育 30 min。7.3.3 取出微量反应板，弃去液体，甩干，立即用洗涤液（5.8）按 7.2.4 条件进行洗板，每次静置30 s后甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干。7.3.4 吸取50 L羧酸酯酶标记物（5.2.3）于空白孔外的每一个微孔。用封板膜密封孔口，于37孵育30 min。7.3.5 按7.3.3步骤重复操作。7.3.6 加入50L显色剂A（5.2.7）和50 L 显色剂 B（5.2.8）于每一个微孔底部，摇匀后于37孵育30 min。7.3.7 迅速加入反应终止液（5.2.9）50 L 于每一个微孔底部，摇匀（此时蓝色立转黄色）。7.3.8 将微量反应板置于酶标仪（6.1）中，在 450 nm 处用空白孔调零点，测定吸光度(加入反应终止液后应在15 min内读取吸光度)。7.4 平行试验 按以上步骤同一标准溶液、同一样品溶液进行平行试验测定。7.5 空白试验 除不称取试样外，其它均按上述步骤进行。8 结果计算 以吸光度值为纵坐标，酯酶的活力（U/L）为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的酯酶活力，结果按公式（1）进行计算。.(1)式中：X-大曲酯酶活力，单位为活力单位/克（U/g）；C 从标准工作曲线上得到的试样酯酶活力，单位为活力单位/升（U/L）；V 试样液体积,单位为毫升(mL)；n 试样液稀释倍数；m 试样的质量,单位为克（g）。注：计算结果保留 2 位有效数字。9 精密度 重复测定结果的相对偏差不得超过 15。_