ICS 65.120 B 46 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 22412014 畜禽饲料中伏马菌素 B1 的测定 酶联免疫吸附法 Determination of fumonisin B1 in animal foodstuffEnzyme linked immunosorbent assay 文稿版次选择 2014-12-17 发布 2015-01-17 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 22412014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准有安徽农业大学提出。本标准起草单位：安徽农业大学、和县畜牧兽医局、马鞍山市农业委员会。本标准起草人：王希春、伋兆法、吴金节、夏效平、陈祥国、李复辉、樊海新、李玉、冯士彬、李贺侠、张宁。DB34/T 22412014 1 畜禽饲料中伏马菌素B1的测定-酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了畜禽饲料中伏马菌素B1 的酶联免疫吸附法测定的术语和定义、原理、设备、试剂、检测步骤。本方法适用于饲料原料或配合饲料中伏马菌素B1 的测定。本方法的最低检测限为 10 g/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 伏马菌素B1 fumonisin B1，FB1 伏马菌素B1 是主要由串珠镰刀菌代谢产生的一种真菌毒素。4 原理 待检样品中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，如待检样品中无抗原，则酶标抗原能顺利的与固相抗体结合。如待检样品中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合。待检样品中抗原含量愈多，结合在固相抗体上的酶标抗原愈少，则其最后加入酶底物后显色也愈浅。颜色的深浅与待检样品中抗原含量成反线性相关。5 设备 5.1 粉碎机（DYF-500）5.2 分析天平（精确到0.001 g）5.3 涡旋混匀器（SZ-1）5.4 酶标仪（MK3，波长450 nm）5.5 酶标板（48孔或96孔）5.6 单道微量移液器（10 L、100 L、1000 L）DB34/T 22412014 2 5.7 多道微量移液器（300 L）6 试剂 6.1 本检测方法所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。6.2 乙腈-水：1:1（V:V）6.3 包被抗原FB1 6.4 FB1 单克隆抗体 6.5 HRP-羊抗小鼠IgG 6.6 包被缓冲液：碳酸钠（Na2CO3）1.59 g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93 g，加水溶解，调pH 至 9.6，定容至1000 mL。6.7 洗涤液PBST：磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）2.9 g，氯化钠（NaCl）8 g，氯化钾（KCl）0.2 g，吐温-20 0.5 mL，加水溶解，调 pH 至 7.4，定容至 1000 mL。6.8 封闭液：5脱脂奶粉，称取 5 g 脱脂奶粉，加入洗涤液至 100 mL，保存于 4冰箱中。6.9 FB1 标准贮备溶液：称取 1 mg FB1 标准品，用乙腈水配制成约 1 mg/mL FB1 贮备液。贮备液置于4冰箱中避光保存。6.10 FB1 标准溶液：精确吸取标定后的标准储备液，用乙腈水新鲜配制成 FB1 标准溶液，浓度分别为2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL。6.11 TMB底物显色液 A液：醋酸钠（C2H3O2Na）13.6 g，柠檬酸（C6H8O7H2O）1.6 g，30双氧水（H2O2）0.3 mL，加水至500 mL。B液：乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.2 g，柠檬酸（C6H8O7H2O）0.95 g，甘油（C3H8O3）50 mL，TMB 0.15 g，加水至500 mL。使用前，A 液和 B 液按 1:1 混合使用。6.12 终止液：2 mol/L H2SO4 溶液。7 检测步骤 7.1 样品 饲料原料或配合饲料。7.2 试样制备 按 GB/T 14699.1 饲料采样方法取得试样 800 g，四分法缩减至 100 g，磨碎，并通过 0.90 mm孔径分子筛。7.3 毒素提取 7.3.1 称取 20 g粉碎并通过 0.90 mm 孔径的分子筛的试样，置于 250 mL 具塞锥形瓶中，加入 100 mL 乙腈水溶液，振荡 30 min，静置后取上清，滤纸过滤。7.3.2 分装滤液，-20保存待测。7.4 检测 7.4.1 将抗原用包被液稀释至需要浓度，在 96孔酶标板上加入 100 L，4过夜。DB34/T 22412014 3 7.4.2 酶标板用 PBST 洗涤3次，每次 3 min，拍干。7.4.3 加入100 L封闭液，37 1 h。7.4.4 PBST 洗涤 3 次，每次3 min，拍干。7.4.5 每孔分别加入不同浓度FB1 标准品溶液、样品提取液50 L，抗体液50 L，空白对照孔加入100 L抗体液，37，1 h。7.4.6 PBST 洗涤 3次，每次 3 min，拍干 7.4.7 加入 100 L酶标二抗，37，1 h。7.4.8 PBST洗涤 3 次，每次 3 min，拍干。7.4.9 加入 100 L A 液 B 液混合后底物溶液，37，1 h。7.4.10 加入 50 L终止液，终止反应。7.4.11 用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度值。7.5 结果处理 7.5.1 绘制标准曲线 以不同浓度 FB1 标准品浓度的对数为横坐标，以 B/B0 百分比为纵坐标（B 为各竞争标准品浓度测得的 OD450 值，B0 为不含标准品时测得的 OD450 值）绘制标准曲线。7.5.2 计算结果 所得实验数据按公式（1）计算：McV XW.(1)式中：W 伏马菌素B1 的浓度，ng/g；c 酶标板上测得的 FB1 的浓度（根据标准曲线求得），ng/mL；V 样品提取液的体积，mL；X 样品提取液稀释倍数；M 样品质量，g；计算结果表示到小数点后一位有效数字。7.6 重复性 在相同条件下获得的两次独立测定结果的相对误差不大于 10。7.7 回收率 本方法的回收率为 8396。DB34/T 22412014 4 A A 附 录 A（资料性附录）伏马菌素 B1标准品的标准曲线 伏马菌素B1 标准品的标准曲线见图A.1。y=-34.715x+87.277R2=0.996101020304050607080900 0.5 1 1.5 2 2.5 3对数(标准品浓度，ng/mL)B/B0%系列1线性(系列1)图A.1 伏马菌素 B1标准品的标准曲线图 _