ICS 11.120.10 C 15 DB35 福建省地方标准 DB35/T 15132015 柑橘属果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的测定 高效液相色谱法 Determination of Content of Narigin,Hesperidin and Neohesperidin in citrus fruits by HPLC 2015-06-26 发布 2015-09-26 实施福建省质量技术监督局 发布 DB35/T 15132015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业厅归口。本标准起草单位：福建省农科院中心实验室 本标准主要起草人：潘葳、刘文静、罗钦。DB35/T 15132015 1 柑橘属果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了芸香科柑橘属植物果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的高效液相色谱测定方法。本标准适用于橘、柑、柚、橙、柠檬、香橼或称枸橼（佛手）等芸香科柑橘属植物果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的测定。本标准方法测定柑橘属植物鲜基中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的定量限均为0.05 g/g，检出限均为0.016 g/g；柑橘属植物干基中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的定量限均为2.5 g/g，检出限均为0.76 g/g。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法。3 原理 试样中的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷用甲醇提取，提取液离心后，取上清液，经微孔滤膜过滤，高效液相色谱-紫外检测法测定，外标法定量。4 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682-2008中一级水的要求。4.1 甲醇（CH4O）：色谱纯。4.2 乙腈（C2H3N）：色谱纯。4.3 冰醋酸（C2H4O2）。4.4 柚皮苷标准品（CAS 520-26-3）：纯度97%（质量分数）。4.5 橙皮苷标准品（CAS 10236-47-2）：纯度98%（质量分数）。4.6 新橙皮苷标准品（CAS 13241-33-3）：纯度 98%（质量分数）。4.7 甲醇（CH4O）。4.8 0.5%乙酸溶液：移取 5.0 mL冰醋酸（4.3），用水稀释并定容至 1000 mL。4.9 流动相：将 20 体积乙腈（4.2）与 80 体积 0.5%乙酸溶液（4.8）混合。使用前经微孔滤膜（5.9）过滤并脱气。4.10 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷混合标准贮备液（1.0 mg/mL）：准确称取柚皮苷（4.4）、橙皮苷（4.5）和新橙皮苷（4.6）标准品各 10 mg（精确至 0.1 mg），于 10 mL 容量瓶中，用甲醇（4.1）溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 1.0 mg/mL 的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷混合标准贮备液。2 8 保存，有效期 2 个月。DB35/T 15132015 2 4.11 柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷混合标准工作液：分别准确移取 0.05 mL、0.5 mL、5.0 mL、10.0 mL、25.0 mL柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷混合标准贮备液（4.10）于不同的 50 mL容量瓶中，用流动相溶液（4.9）稀释并定容至刻度，摇匀，得到不同浓度的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷混合标准工作溶液（质量浓度分别为 1 g/mL、10 g/mL、100 g/mL、200 g/mL、500 g/mL），即配即用。5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。5.2 电子天平：感量 0.1 mg。5.3 鼓风干燥箱：温度可控。5.4 高速万能粉碎机：转速 24 000 r/min，或相当的设备。5.5 组织捣碎机：转速 12 000 r/min，或相当的设备。5.6 超声波清洗器：超声波频率 40 kHz，或相当的设备。5.7 离心机型号 1：体积 50 mL，转速不低于 4 000 r/min或相当的设备。5.8 离心机型号 2：体积 2 mL，转速不低于 10 000 r/min 或相当的设备。5.9 微孔滤膜：0.22 m，直径 25 mm的聚砜膜或相当者。5.10 离心管：1 mL（具塞）。5.11 分样筛：筛网孔径为 425 m。6 分析步骤 6.1 样品前处理 6.1.1 鲜基样品 取一份柑橘属植物果实样品，将柑橘属果实分成果皮、果瓤两部分，分别将果皮切碎、果瓤掰碎，称取有代表性的样品 100.0 g，放入组织捣碎机（5.5）中，加入 100 mL甲醇（4.7），匀浆，用离心机（5.7）4 000 r/min 离心 10 min，将上清液转移到 250 mL 容量瓶，残渣加入 50 mL 甲醇（4.7），用超声波清洗器（5.6）于 35 超声波萃取 15 min，用离心机（5.7）4 000 r/min离心 10 min，合并上清液于 250 mL容量瓶中。再用 50 mL甲醇（4.7）重复以上萃取和离心步骤，合并上清液于 250 mL 容量瓶中，用甲醇（4.7）定容至刻度，摇匀。取一定量的提取液，用离心机（5.8）以 10 000 r/min 高速离心10 min，分离沉淀蛋白质、果胶等干扰物质，取上清液用微孔滤膜（5.9）过滤，滤液供上机分析（72 h完成测定）。6.1.2 干基样品 将柑橘属果实分成果皮、果瓤两部分，分别将果皮切碎、果瓤掰散，在 60 2 下干燥至恒重，冷却至室温，粉碎，过分样筛（5.11），制备的样品粉末保存于干燥器内备用。称取约 0.1 g（精确到0.1 mg）样品于 25 mL容量瓶中，加 20 mL 甲醇（4.7），于 35 超声加热提取 30 min，冷却至室温，定容，取一定量的提取液，用离心机（5.8）以 10 000 r/min 高速离心 10 min，取上清液用微孔滤膜（5.9）过滤，滤液供上机分析（72 h 完成测定）。6.2 样品测定 6.2.1 高效液相色谱参考条件 DB35/T 15132015 3 以下分析条件可供参考，采用其它条件应验证其适用性：色谱柱：C18柱，长 150 mm，内径 4.6 mm，粒径 3 m，或性能相当者。柱温：40；紫外检测波长：283 nm；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 L。6.2.2 液相色谱测定 分别取适量的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷标准工作溶液（4.12）及待测样液，按 6.2.1 列出的条件进行液相色谱分析测定。由保留时间进行定性，外标法定量，根据标准工作溶液的浓度及柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷响应峰面积，建立标准工作曲线。工作曲线线性相关系数 R20.99。待测样液中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。分析间每 20 次样品测定后应加入一个与样品峰面积相近的标准工作液，如果测得的值与原值相对平均偏差超过 5%，则应重新进行标准曲线的制作。标准样品及典型样品色谱图参见附录 A。7 结果计算与表示 7.1 结果计算 柑橘属植物果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量按式（1）进行计算：310 mf V cX.(1)式中：X试样中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量（以质量分数计），单位为毫克每克（mg/g）；c由标准工作曲线得出的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；f试样稀释倍数；m试样质量，单位为克（g）。7.2 结果表示 测定结果以平行测定的算术平均值表示，计算结果保留两位有效数字。在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8 精密度和回收率 本方法的精密度和回收率试验结果参见附录 B。9 检验报告 检验报告应包括以下内容：识别被测试样需要的所有信息；依据本标准方法；DB35/T 15132015 4 柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的测定结果；实验日期；测定人员。此外，还需说明使用的方法，还应包括本标准未规定的或选择性的条件，以及可能影响结果的其它条件。测试报告应包括试样的唯一性资料。DB35/T 15132015 5 A A 附 录 A（资料性附录）色谱图示例 标准溶液及典型样品色谱图示例分别见图A.1图A.15。AU-0.0020.0000.0020.0040.0060.008min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00柚皮苷-8.988橙皮苷-10.219新橙皮苷-12.328 图A.1 标准溶液色谱图 AU0.000.020.040.060.080.100.12min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00柚皮苷-8.899橙皮苷-10.077新橙皮苷-12.185 图A.2 胡柚皮试样色谱图 AU0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.030min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00柚皮苷-8.896橙皮苷-10.067新橙皮苷-12.179 图A.3 胡柚瓤试样色谱图 DB35/T 15132015 6 AU0.000.020.040.060.080.100.120.14min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00柚皮苷-8.914 图A.4 柚子皮试样色谱图 AU-0.020.000.020.040.060.08min3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00柚皮苷-8.914 图A.5 柚子瓤试样色谱图 AU0.000.050.100.15min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.090 图A.6 皇帝柑皮试样色谱图 AU0.000.050.100.150.200.25min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.037 图A.7 皇帝柑瓤试样色谱图 DB35/T 15132015 7 AU0.000.100.200.300.40min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.070 图A.8 福橘皮试样色谱图 AU0.000.020.040.060.080.100.120.140.16min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.070 图A.9 福橘瓤试样色谱图 AU0.000.020.040.060.080.100.120.140.16min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.070 图A.10 红山橙皮试样色谱图 AU0.000.020.040.060.080.100.120.14min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.046 图A.11 红山橙瓤试样色谱图 DB35/T 15132015 8 AU0.000.020.040.060.080.100.12min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.065 图A.12 柠檬皮试样色谱图 AU0.000.020.040.060.080.10min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.083 图A.13 柠檬瓤试样色谱图 AU-0.0020.0000.0020.0040.0060.0080.0100.0120.0140.0160.0180.020min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.231 图A.14 建佛手试样色谱图 AU0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.030min1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00橙皮苷-10.259 图A.15 广佛手试样色谱图 DB35/T 15132015 9 B B 附 录 B（资料性附录）精密度和回收率试验研究结果 本方法的精密度和回收率研究结果见表B.1。表B.1 本方法的精密度和回收率试验研究结果 样品名称 检测参数 RSD%（n=6）平均回收率%日内 日间 低 中 高 胡柚皮 柚皮苷 2.8 1.8 97.6 99.3 99.6 橙皮苷 1.8 3.2 97.5 99.8 98.8 新橙皮苷 2.4 1.6 98.6 99.5 99.1 胡柚瓤 柚皮苷 2.0 1.1 97.7 97.3 98.8 橙皮苷 2.9 3.4 96.5 97.8 96.9 新橙皮苷 3.2 2.8 99.1 96.7 98.3 柚子皮 柚皮苷 2.6 1.9 97.9 97.9 99.4 橙皮苷/99.2 99.3 98.2 新橙皮苷/99.1 99.3 98.2 柚子瓤 柚皮苷 2.6 2.1 96.6 97.2 96.7 橙皮苷/98.9 99.1 98.4 新橙皮苷/99.0 99.1 98.3 皇帝柑皮 柚皮苷/98.9 99.2 98.3 橙皮苷 1.1 1.8 98.1 99.6 98.9 新橙皮苷/99.1 98.9 98.4 皇帝柑瓤 柚皮苷/98.5 99.3 98.2 橙皮苷 2.4 3.3 97.0 96.4 97.4 新橙皮苷/98.9 98.7 98.0 福橘皮 柚皮苷/98.7 99.1 98.0 橙皮苷 1.8 2.0 96.8 98.6 99.1 新橙皮苷/99.1 99.2 98.6 福橘瓤 柚皮苷/99.3 99.0 98.0 橙皮苷 2.9 1.9 96.0 96.8 99.3 新橙皮苷/99.0 99.4 98.1 红山橙皮 柚皮苷/99.2 99.2 97.5 橙皮苷 1.0 2.9 99.0 98.9 99.5 新橙皮苷/99.2 99.5 98.4 红山橙瓤 柚皮苷/98.9 99.5 97.6 橙皮苷 1.5 1.5 96.7 98.0 98.8 新橙皮苷/98.9 99.6 97.6 DB35/T 15132015 10 表B.1（续）本方法的精密度和回收率试验研究结果 样品名称 检测参数 RSD%（n=6）平均回收率%日内 日间 低 中 高 柠檬皮 柚皮苷/98.1 98.6 96.5 橙皮苷 2.5 2.6 98.1 98.9 99.2 新橙皮苷/97.8 98.1 97.0 柠檬瓤 柚皮苷/98.7 98.3 96.7 橙皮苷 2.7 3.3 97.9 97.1 99.2 新橙皮苷/98.1 98.3 97.2 建佛手 柚皮苷/98.0 98.8 96.5 橙皮苷 3.2 2.3 97.3 98.4 99.2 新橙皮苷/99.0 98.2 97.2 广佛手 柚皮苷/98.1 98.8 97.5 橙皮苷 1.8 3.1 97.9 98.5 99.6 新橙皮苷/98.7 99.0 97.5 _ DB35/T 15132015 福建省地方标准 柑橘属果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷 的测定 高效液相色谱法 DB35/T 15132015*2015年 11 月第一版 2015年 11 月第一次印刷