ICS 65.020.20 B 23 备案号：44848-2015 DB63 青 海 省 地 方 标 准 DB63/T 13482015 马铃薯茎尖超低温离体保存技术规范 2015-02-09发布 2015-03-15实施 青海省质量技术监督局 发 布 DB63/T 13482015 I 前 言 本规范的编写符合GB/T 1.1-2009的规定。本规范由青海省农林科学院提出并归口。本规范起草单位：青海省农林科学院生物技术研究所。本规范主要起草人：王芳、贺苗苗。DB63/T 13482015 1 马铃薯茎尖超低温离体保存技术规范 1 范围 本规范规定了马铃薯茎尖超低温保存的技术、工作程序、恢复培养和抽检，以及超低温保存的注意事项。本规范适用于青海省农业科研、技术推广、种子部门对马铃薯茎尖进行超低温保存时使用。2 术语定义及缩略语 2.1 术语与定义 下列术语和定义适用于本规范。2.1.1 超低温保存 指在液氮液相(196)或液氮雾相(150)中对马铃薯试管苗的茎尖进行长期保存。2.1.2 玻璃化 用一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液处理材料，在投入液氮中，保护剂和细胞内的水分子不会形成冰晶，固化成无定形的玻璃化状态，保证细胞有再生的活力的过程。2.2 缩略语 MS-基础培养基 KT-是激动素 GA3-赤酶素 IAA-吲哚乙酸 3 超低温保存技术与工作程序 3.1 环境要求 操作过程中所需器械均需灭菌；整个操作过程在超净工作台内进行；操作人员均需严格按照无菌操作条件进行。3.2 茎尖处理 选用2.00 cm试管苗顶端置于40倍（目镜10倍，物镜4倍）的体视镜下，用镊子夹住茎段，用解剖针（刀）除去生长点周围的幼叶，露出顶端分生组织圆锥体，切取附带1个-2个叶原基的茎尖，其大小为DB63/T 13482015 2 1.5 mm-2.00 mm。剥离后的茎尖立即置于保存液中，保存液成分：0.10 mol/L 蔗糖+MS基础培养基，pH 5.8，高温灭菌。3.3 茎尖预培养 将保存液中的茎尖在预培养基上培养4h。预培养基的成分：MS基础培养基+0.04 mg/L KT+0.10 mol/L 蔗糖、pH 5.80，过滤灭菌。3.4 装载处理 将经过预培养的茎尖在室温下浸泡于装载液中进行装载处理，装载时间为40 min。装载液的成分：MS基础培养基+2.00 mol/L 甘油+0.400 mol/L 蔗糖，pH 5.8，高温灭菌。3.5 玻璃化 茎尖经过装载处理后，用滤纸吸去残留的液体，放入经过0 预冷的玻璃化液中，冰浴30 min-40 min。玻璃化液成分：MS基础培养基+30.00%甘油+15.00%乙二醇+15.00%二甲基亚砜+0.40 mol/L蔗糖，PH 5.80，高温灭菌。3.6 保存 将按4.1-4.5条处理后的茎尖，装入1.80 mL的冷冻管中，加入新的玻璃化液后注入液氮，盖上盖子迅速投入液氮罐中进行保存。超低温保存技术注意事项，见附录1。4 恢复培养与检测 4.1 化冻、洗涤技术 将冷冻管从液氮中取出，室温下将冷冻管打开盖子后注入恢复培养液90 s左右，用吸管吸出解冻液体，加入恢复培养液，轻微混匀，在第5 min、15 min时更换新的恢复培养液，第25 min用滤纸吸去茎尖上的恢复培养液，将茎尖转接在恢复培养基中。恢复培养液成分：MS基础培养基+1.2 mol/L 蔗糖，pH 5.8；恢复培养基成分为：MS基础培养基+12.00 mol/L 蔗糖+0.5 mg/L IAA+0.04 mg/L KT+0.1 mg/L GA3，pH 5.80。4.2 恢复培养条件 恢复培养条件：暗培养10 d，弱光条件（光照500 lx-800 lx）下培养10 d，正常条件2000 lx-3000 lx。培养温度均为21.00 2.00。4.3 成苗率统计 茎尖在恢复培养基上培养40 d后观察成苗率。经恢复培养后，茎尖发育成苗的百分率不能低于40%。4.4 抽检 每半年抽检一次，当成苗率低于20%时，该批次材料淘汰。A DB63/T 13482015 3 附 录 A（规范性附录）液氮保存注意事项 A.1 根据需要和使用的次数，分别包装成不同量的小包进行冷冻保存。避免大包装因启封而使保存材料受外界温湿度急剧升高的影响。A.2 包装茎尖分生组织选用冷冻管。A.3 将冷冻管装入布口袋中，口袋里放上小铁块等重物，可以使布袋放入液氮后能浸入到液氮中，口袋要用细绳系好后才能投入液氮罐中保存，留在外面的细绳要附上标记。A.4 条件允许时，也可用专用的超低温保存液氮罐，样品放在保存架上，直接浸入到液氮内。_