ICS 61.060 Y 78 DB51 四川省地方标准 DB51/T 17932014 青稞黑穗病检疫鉴定方法 2014-07-25发布 2014-09-01实施四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 17932014 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 设备和材料.1 5 培养基和试剂.2 6 样品的采集、运输和保存.2 7 实验室检验.2 8 结果判定.4 9 废弃物处理和防止污染的措施.4 附录 A（规范性附录）培养基和试剂.5 DB51/T 17932014 II 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准的附录A为规范性附录。本标准由四川出入境检验检疫局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心、四川农业大学小麦研究所、四川省甘孜藏族自治州农业科学研究所。本标准主要起草人：谭志、刘亚西、杨开俊、王际睿、胡江涛、帅培强、于刚。DB51/T 17932014 1 青稞黑穗病检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了青稞黑穗病植株的检疫鉴定方法。本标准适用于青稞黑穗病植株的检疫鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 SN/T 1193 基因检测实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 青稞黑穗病 smut disease in huless Barley 青稞坚黑穗病菌Ustilago hordei(Pers.)Lagerh和散黑穗病菌Ustilago nuda(Jens.)Rostr同属于真菌界Fungi，担子菌纲Basidiomycetes，蕉孢亚纲Teliosporae，黑粉菌目Ustilaginales,黑粉菌科Ustilaginaceae，黑粉菌属Ustilago。青稞坚黑穗病菌和青稞散黑穗病菌侵染青稞时，孢子堆生于花器，一般破坏病穗的全部小穗，内部全为黑褐色或黑色粉末。青稞黑穗病的病状特点、病原菌孢子形态和基于分子生物学的检测是检疫鉴定青稞坚黑穗病菌和青稞散黑穗病菌的依据。4 设备和材料 除微生物实验室和分子生物学实验室常规灭菌、培养、样品前处理设备外，其他设备和材料如下：4.1 培养箱：281。4.2 生物显微镜。4.3 体视显微镜。4.4 核酸蛋白分析仪。4.5 纯水系统。4.6 超净工作台。4.7 PCR 仪。4.8 电泳仪。4.9 电泳槽。4.10 凝胶分析成像系统。DB51/T 17932014 2 5 培养基和试剂 5.1 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：见附录 A 中A.1。5.2 马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：附录 A 中A.2。5.3 商品化微生物真菌基因组 DNA 提取试剂盒。5.4 青稞坚黑穗病菌扩增引物：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3 5-CCTCCGCTTATTGATATGC-3。5.5 青稞散黑穗病菌扩增引物：5-TGTGGCTCGCACCTGTCCAAC-3 5-TTCTCCTTGCGTCGCGCTGT-3。5.6 PCR检测试剂：MgCl2、dNTPs、Taq聚合酶等。5.7 PCR 产物染色剂 GoldenView（GV）。6 样品的采集、运输和保存 在田间采集青稞黑穗病植株上的发病穗，采集宜在病穗外部包膜未破裂时进行。采集人员带无菌手套，在离田块四边410步（米）远的各处，随机选择5个点取样,每点用无菌剪刀剪下2个病穗，置于无菌采样袋中。记录下采集时间、地点、采集人。所采集病穗采样袋送回实验室后，在通风处阴干，在干燥条件下保存，1周内进行实验室检验。7 实验室检验 7.1 病穗症状观察 7.1.1 观察方法 用体视镜或肉眼直接观察采集回的病穗。7.1.2 病穗特征 7.1.2.1 感染青稞坚黑穗病菌病穗特征：孢子堆生于花器，一般破坏病穗的全部小穗，抽出时有白色膜状包被，膜较坚实，不易碎裂，内部全为黑色粉末，但不易飞散，只残存穗轴和芒。7.1.2.2 感染青稞散黑穗病菌病穗特征：孢子堆生于花器，一般破坏病穗的全部小穗，表面先为白色薄膜所包被，膜易碎裂，内部全为黑褐色或黑色的疏松粉末，易飞散，只残存穗轴和芒，芒变白干枯。7.2 显微镜镜检 DB51/T 17932014 3 7.2.1 样品制备：从病穗内取出少量黑色粉末，以水作浮载剂，制成玻片，在显微镜下观察孢子大小及形态。7.2.2 病穗内孢子特征 7.2.2.1 感染青稞坚黑穗病菌病穗内孢子特征：孢子呈球形或椭圆形，表面光滑，绿褐色至深褐色，一边颜色稍淡，直径49 m，萌芽生圆柱型的担子，每一细胞上仅生担孢子（小孢子）1个，但可连续产生。7.2.2.2 感染青稞散黑穗病菌病穗内孢子特征：孢子球形或稍长，褐色，一边颜色稍淡，表面布满细刺，直径59 m（6.5956.5 m），萌芽生菌丝。7.3 分子生物学方法检验 7.3.1 样品制备 在超净工作台上用接种环挑取病穗中黑色的孢子于1 mL无菌生理盐水中，混匀。取100 L涂布于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，28 培养35天。挑取马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上的菌落，接种于马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，在摇床中以130 r/min，28 恒温振荡培养35天。取培养液20 mL，8000 r/min室温离心5 min，弃去上清，取菌体用于提取菌株基因组DNA。7.3.2 基因组DNA提取 采用商品化微生物真菌基因组DNA提取试剂盒，根据说明书的操作步骤，提取病原菌基因组DNA。7.3.3 青稞坚黑穗病菌 PCR 反应体系配制 25 L的PCR反应体系包括：1.5 mM MgCl2；0.2 mM dNTPs；0.1 mM的前引物（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3）；0.1 mM的后引物（5-CCTCCGCTTATTGATATGC-3）；0.5单位的Taq聚合酶；25 ng的基因组DNA。7.3.4 青稞散黑穗病菌 PCR反应体系配制 25 L的PCR反应体系包括：1.5 mM MgCl2；0.2 mM dNTPs；0.1 mM的前引物（5-TGTGGCTCGCACCTGTCCAAC-3）；0.1 mM的后引物（5-TTCTCCTTGCGTCGCGCTGT-3）；0.5单位的Taq聚合酶；25 ng的基因组DNA。7.3.5 阴阳性对照 用坚黑穗病菌和散黑穗病菌标准菌株DNA作为阳性对照模板扩增，用超纯水作为阴性对照模板扩增。7.3.6 PCR反应程序 第一步：95 预变性5 min；第二步：95 变性30 s，55 60 退火1 min，72 延伸1 min；第三步：循环第二步4045次；第四步：72 延伸2 min。7.3.7 扩增结果电泳检测 DB51/T 17932014 4 2%琼脂糖凝胶检测，加入溴酚蓝和二甲苯青作为电泳指示剂，Goldenview染色DNA，以100 bp Ladder DNA Marker为条带大小参照标准，电压8 V/cm，电泳时间30 min，凝胶分析成像系统观察，坚黑穗病菌PCR扩增产物显示单一条带，790 bp，判定为含有坚黑穗病菌基因组DNA；散黑穗病菌PCR扩增产物显示单一条带，760 bp，判定为含有散黑穗病菌基因组DNA。8 结果判定 8.1 青稞坚黑穗病菌 病穗外观症状和病原菌孢子形态符合7.1.2.1和7.2.3.1描述者，即可鉴定为青稞坚黑穗病菌。按7.3.3PCR扩增后电泳检测结果为含有坚黑穗病菌基因组DNA，鉴定为青稞坚黑穗病菌。8.2 青稞散黑穗病菌 病穗外观症状和病原菌孢子形态符合7.1.2.2和7.2.3.2描述者，即可鉴定为青稞散黑穗病菌。按7.3.4PCR扩增后电泳检测结果为含有散黑穗病菌基因组DNA，鉴定为青稞散黑穗病菌。废弃物处理和防止污染的措施。9 废弃物处理和防止污染的措施 检验过程中的废弃物，收集后焚烧处理。检验过程中需防止交叉污染，按GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求和SN/T 1193 基因检测实验室技术要求标准进行规范操作。DB51/T 17932014 5 A A 附 录 A（规范性附录）培养基和试剂 A.1 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）A.1.1 成分 马铃薯浸出粉 6.0 g 葡萄糖 20.0 g 琼脂 12.0 g 蒸馏水 10 00.0 m L A.1.2 制法 将上述成分混合加热溶解，分装，121灭菌15min。取出后冷却至45 50，倾注平板。A.2 马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）A.2.1 成分 马铃薯浸出粉 6.0 g 葡萄糖 20.0 g 蒸馏水 10 00.0 m L A.2.2 制法 将上述成分混合加热溶解，分装，121灭菌15 min。_ DB51/T 17932014