ICS 65.0 20.2 0B1 6DB35福建省地方标 准DB35/T 15752016水稻稻曲病菌分离鉴定技术规程2 0 1 6-0 4-0 6发 布 2 0 1 6-0 7-0 6实 施福建省质量技术监督局发布福建省地方标准水稻稻曲病菌分离鉴定技术规程DB35/T1575 2016*2016 年7 月第一版 2016 年7 月第一次印刷D B 3 5/T 15 7520 16I目 次前言.II1范 围.12 标本的采集与保存.13 分离技术.13.1 培养基的配制.13.2 稻曲球消毒.13.3 稻曲球捣碎液制备.13.4 稻曲球捣碎液涂布平板.13.5 分离纯化.23.6 形态学鉴定.23.7 保 存.24 分子鉴定.24.1 稻曲病菌 DNA 制备.24.2 P C R 检测.24.3 琼脂糖凝胶电泳.24.4 P CR 鉴定结果.2附录 A（规范性附录）水稻稻曲病标本特征.3附录 B（资料性附录）水稻稻曲病菌小菌落特征.4附录 C（规范性附录）水稻稻曲病菌形态学特征.5附录 D（资料性附录）稻曲病菌 PCR 鉴定结果.6DB 35/T 15 7520 16II前 言本标准按G B/T 1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所、福建省农业科学院水稻研究所。本标准主要起草人：陈福如、石妞妞、郑长林、杜宜新、杨秀娟、阮宏椿、甘林。D B 3 5/T 15 7520 161水稻稻曲病菌分离鉴定技术规程1范 围本标准规定了水 稻稻曲病菌Us ti la gi no id ea v i r e n s（Cooke）Tak.标本的采集和保 存、水稻稻曲病菌的分离技术和鉴定技术。本标准适用于对水稻稻曲病菌的分离、鉴定。2 标本的采集与保存于水稻成熟 期从田 间剪取有黄色 稻曲球的稻穗，其症状 特征见附录A；按单 个稻穗装入 牛皮纸 袋，贴上标签，注明采集时间、地点和水稻品种，带回实验室分离或于4 冰箱保存（保存时间不超过6 0 d）。3 分离技术3.1 培养基的配制胁本哲氏培养基：将去皮马铃薯300 g切成小块，加水1 0 0 0 m L 煮沸2 5 m in，用四层纱布过滤，过滤液中加入琼脂1 6 g，待琼脂完全融化后加入蛋白胨5 g、蔗糖 1 5 g、C a(N O3)2 4H2O0.5g、Na2HP O4 12 H2O 2 g，加水定容至1 000 m L，在121 下湿热灭菌25 m i n。抑制细菌 生长的 胁本 哲氏培养基：待 培养基 冷却 至 60 左右加入 配置好的 1104 gm L-1氯霉素母液，使其终浓度为50 gm L-1。马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)：将去皮马铃薯200 g切成小块，加水1 000 m L煮沸25 m i n,用四层纱布过滤，过滤液 中加入 琼脂16 g，待琼 脂完全融化后加入 蔗糖 20 g，加水定 容至1 0 0 0 m L，在121 下湿热灭菌25 m in。马铃薯 蔗糖培养 液（PS）：将去皮马铃薯 200 g切成小 块，加水 1 0 0 0 m L 煮沸 2 5 min,用 四层纱布过滤，过滤液中加入蔗糖 20 g，加水定容至1 000 m L，在121 下湿热灭菌25 m in。3.2 稻曲球消毒用无菌 手术刀刮除稻曲球 外表层的 杂菌，用无菌水 冲洗，再 用75%的乙醇 溶液消毒 3 0 s，5%次氯酸钠水溶液消毒3 min，无菌水清洗3次。3.3 稻曲球捣碎液制备将消毒好的单粒稻曲 球放入无菌培养皿中，加入4 mL无菌水，用无菌手术刀捣碎稻 曲球组织后，制备含厚垣孢子和菌丝组织碎块的稻曲球捣碎液。3.4 稻曲球捣碎液涂布平板用移液枪吸取0.2 mL捣碎液涂布于抑制细菌生长的胁本哲氏培养基表面。3.5 分离纯化DB 35/T 1 5 7 520 162无菌通风条件下风干 培养基表面后，将培养皿 倒置于恒温箱中，28 黑暗培养 8 d 后，选取质地致密、直径2 m m 3 mm 的黄色或白色小菌落(其特征参见附录B)，用接种针从菌落边缘挑取菌丝块移至 胁本哲氏培养基中培养1 0 d。3.6 形态学鉴定在显微镜下观察厚垣孢子和分生孢子的形态，符合附录C所描述形态特征的初步认定为稻曲病菌。3.7 保 存将经鉴定的稻曲病菌菌株移至P S A 斜面培养基中培养10 d 后，保存于4 冰箱中，备用。4 分子鉴定4.1 稻曲病菌 DNA 制备将经 形态学 鉴定的 稻曲 病菌 菌株 在PS A平板 上培 养5 d后，沿菌落 边缘切 取菌丝 块转接 到 P S培养 液中，2 8、150 r/min摇床上振荡培养1 0 d 后，真空抽滤收集菌丝体，经冷冻干燥或液氮研磨成菌丝粉后，采用十六烷基三甲基溴化铵法提取D N A。4.2 P C R 检 测4.2.1 反应体系P C R 扩增使用引物U S-S F和U S-S R，序列分别为5-T CG CC TC AG AC CT CA AT C-3、5-G AG CC TC AA AT GC CT TC C-3。PC R 反应 体系为 25 L，包含10 0 ng L-1待测样品DN A 1 L、10 m o lmL-1引物对 各 1 L、包含dN TP 的 Ta q M i x(2 X)12.5 L和dd H2O9.5 L。阴性 对照为ddH2O，阳性 对照为已知的稻曲病菌D N A。4.2.2 反应条件P C R扩增程序：94 预变性4 m i n；94 变性3 5 s，5 5 退火35 s，72 延伸4 0 s，3 5 个循环；最后7 2 延伸7 min，1 6 保温。4.3 琼脂糖凝胶电泳将1 0 L P CR反应产物于含 0.5 gmL-1溴化乙锭、质 量分数为1.5%琼脂糖凝胶上 电泳分离，并以1 5 0 0 bp的marker做指示条带，电压为8 V/cm，时间为45 m i n，在凝胶成像系统上检测并拍照。4.4 P CR 鉴定结果当阳性对照出现2 5 7 b p 条带、而阴性对照未出现条带，所测菌株出现 257 b p条带时，判定所测菌株为水稻稻曲病菌；当所测样品未出现2 5 7 b p 条带，判定所测菌株非水稻稻曲病菌，参见附录D。D B 3 5/T 15 7520 163附录A（规范性附录）水稻稻曲病标本特征田间发病初期新鲜稻曲球标样为扁平、光滑、黄色稻曲球，表面布满橘黄色的粉状物。水稻稻曲病症状特征见图A.1。图 A.1 水稻稻曲病标本特征DB 35/T 1 5 7 520 164B A附录B（资料性附录）水稻稻曲病菌小菌落特征B水稻稻曲病菌在胁本哲氏培养基上培养8 d后呈现质地致密、直径 2 m m 3 m m 的黄色或白色小菌落（图B.1、图B.2、图B.3）。图 B.1 水稻稻曲病菌小菌落特征（示全皿）图 B.2 水稻稻曲病菌小菌落特征（示局部）图 B.3 水稻稻曲病菌单菌落特征D B 3 5/T 15 7520 165C C附录C（规范性附录）水稻稻曲病菌形态学特征水稻稻曲 病菌厚垣孢子单胞，大小为（4.5 m7.8 m）（4.5 m7.0 m）；球形或椭 圆形，具刺，橄榄色，表面有疣突（图C.1），分生孢子梗直径 2.0 m2.5 m，分生孢子为薄壁孢子，大小为（2.6 m8.0 m）（2.0 m5.0 m）；卵圆形或长圆形，单胞，无色，透明，外 表光滑（图C.2）。图 C.1 水稻稻曲病菌厚垣孢子图 C.2 水稻稻曲病菌分生孢子DB 35/T 1 5 7 520 166D D附录D（资料性附录）稻曲病菌 P C R 鉴定结果泳道18为稻曲病菌，出现2 5 7 bp条带，M代表1500 b p M arker，泳道916非稻曲病菌。稻曲病菌P C R鉴定结果见图D.1。图 D.1 稻曲病菌 P C R 鉴定结果