ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 23412015 鸭传染性浆膜炎诊断技术规程 Protocol of diagnosis for Riemerella anatipestifer infection 2015-11-25发布 2015-12-25实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 23412015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009和GB/T 20001.42001中给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位:吉林大学。本标准主要起草人:郭娜、刘宗慧、张燕、卜秀娟、赵星辰、史册。DB22/T 23412015 1 鸭传染性浆膜炎诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鸭传染性浆膜炎病原鸭疫里默氏杆菌的分离及聚合酶链式反应（PCR）鉴定技术。本标准适用于鸭传染性浆膜炎诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 鸭传染性浆膜炎 infectious serositis 鸭传染性浆膜炎又名鸭疫里氏杆菌病，原名鸭疫巴氏杆菌病，是家鸭、家鹅、火鸡和多种家禽和野禽的急性或慢性传染病。3.2 鸭疫里默氏杆菌 Riemerella anatipestifer 鸭疫里默氏杆菌是革兰氏阴性小杆菌，是鸭传染性浆膜炎的病原菌。4 仪器与设备 4.1 PCR 扩增仪 4.2 电泳仪 4.3 凝胶成像分析仪 4.4 5%二氧化碳培养箱 5 试剂与材料 5.1 水：符合 GB/T 6682 中二级水规定。5.2 对照品：鸭疫里默氏杆菌标准菌株（ATCC 11845）DNA 提取物作为阳性对照，大肠杆菌和沙门氏菌提取物作为阴性对照，双蒸水作为空白对照。DB22/T 23412015 2 5.3 引物：上游引物 5-GATTAGATAGTTGGTGAG-3,下游引物5-GGTGTTCTGAGTAATATC-3，参考鸭疫里默氏菌 16s rRNA 基因序列设计的引物，扩增长度为 473 bp，稀释成 20 mol/L 使用。5.4 琼脂糖（电泳纯）。5.5 溴化乙锭：10 mg/mL。5.6 TAE 电泳缓冲液：参照附录 A 配制。5.7 DNA 相对分子质量标准物 Marker：DL2000。5.8 DNA 提取和PCR 扩增试剂盒。6 鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定 6.1 样品采集 应按照NY/T 541规定的方法采集濒死鸭（火鸡、鹅）或死亡后不久鸭的（火鸡、鹅）肝脏或脑。6.2 细菌的分离 6.2.1 将样品研磨并划线接种在血液琼脂平板上，置于 5%二氧化碳培养箱（4.4）中，37 1 下培养，24 h48 h 后观察结果。6.2.2 菌落呈圆形，表面光滑有光泽，微凸起，并且呈奶油状，直径约为 1 mm2 mm，可以判为可疑菌落，挑取可疑菌落进一步鉴定。6.2.3 挑取单个菌落接种于血清肉汤当中，置于 5%二氧化碳培养箱（4.4）中，37 1 下培养，24 h48 h，备用。6.2.4 将 6.2.3 培养液计数调整至浓度为 1109 CFU/mL，取 0.2 mL接种 7 日龄雏鸭。动物接种试验应按照 GB 19489 的规定执行。取 24120 h 死亡雏鸭的脑和肝脏，进行细菌分离。6.3 PCR 鉴定 6.3.1 扩增引物 上游引物5-GATTAGATAGTTGGTGAG-3 下游引物5-GGTGTTCTGAGTAATATC-3 6.3.2 模板DNA 制备 取6.2.4分离的菌落，采用商品化DNA提取试剂盒进行DNA模板的制备，按照说明书要求进行操作。6.3.3 DNA 扩增 在PCR反应体系中加入10PCR缓冲液2.5 L、5U/L Taq DNA聚合酶1 L、20 mol/L的上、下游引物各1 L、10 mmol/L dNTPs 1 L、5 L的模板DNA，补充灭菌水至50 L。94 预变性5 min；之后94 变性1 min，53 退火1 min，72 延伸2 min，共30个循环；72 补充延伸10 min，4 保存（4.1）。以鸭疫里默氏杆菌标准株作为阳性对照，以沙门氏菌和大肠杆菌作为阴性对照，用水作为空白对照。6.3.4 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，微波炉加热充分溶解后加入溴化乙锭使其浓度为1 g/mL。将凝固好的琼脂糖凝胶放入水平电泳槽，倒入电泳液使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 L样品和上样缓冲DB22/T 23412015 3 液按比例混匀后匀速加入样品孔。电泳时使用DNA相对分子质量标准物Marker作对照。设置电泳仪（4.2）电压为160 V，时间为20 min。使用凝胶成像分析仪拍照（4.3）。7 结果判定 电泳结果与阳性对照出现相同条带，且阴性对照和空白对照无相应扩增条带即可判定为阳性，否则判定为阴性。如需进一步鉴定，需进行测序比对，见附录B，PCR扩增的鸭疫里默氏杆菌16s rRNA基因序列。DB22/T 23412015 4 A A 附 录 A（资料性附录）TAE 电泳缓冲液配制 A.1 TAE电泳缓冲液（50 倍浓缩液）配制 242 g 的Tris和37.2 g 的Na2 EDTA 2H2O，加800 mL水充分搅拌溶解后，加入57.1 mL的醋酸，加蒸馏水定容至1000 mL，室温保存。使用时用蒸馏水稀释50倍即可。DB22/T 23412015 5 B B 附 录 B（规范性附录）PCR 扩增的鸭疫里默氏杆菌 16s rRNA基因序列 B.1 PCR扩增的鸭疫里默氏杆菌 16s rRNA基因序列 cggctcaccaagtcaatgatctttagggggcctgagagggtgatcccccacactggtactgagacacggaccagactccta cgggaggcag cagtgaggaa tattggacaatgggtgcaagcctgatccagccatcccgcgtgaaggacgacggccctatgggttgtaaacttcttttgtacagggataaacctactctcgtgagggtagctgaaggtactgtacgaataagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttatccggatttattgggtttaaagggtccgcaggcgggctagtaagtcagtggtgaaagcctacagcttaactgtagaactgccgttgatactgctag tcttgagtat agttgaggta gctggaatga gtagtgtagcggtgaaatgcatagatattactcagaacaccgattgcgaaggcaggttacta _