ICS 65.020.20 B 05 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 2404 2016 猪流行性 腹泻病毒RT-PCR 检 测方法 2016-09-30 发布 2016-12-01 实施 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB13/T 2404 2016 I 前 言 GB/T 1.1-2009 DB13/T 2404 2016 1 猪流行性 腹泻病 毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 RT-PCR 2 缩略语 DEPC diethypyrocarbonate dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate EB ethidium bromide PCR polymerase chain reaction RNA ribonucleic acid RT-PCR-reverse-transcription polymerase chain reaction Vero cDNA 3 主要仪 器 3.1 PCR 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4 主要试 剂 4.1 LS TRIzol RNA RNA 4.2 4.3 1.0%A A.1 4.4 50 TAE A A.2 DB13/T 2404 2016 2 4.5 10 ug/L EB A A.3 4.6 DEPC A A.4 4.7 DNA 100 bp 4.8 4.9 RNA 4.10 Dye 4.11 dNTP 4.12 RT-PCR RT-PCR dNTP RNA 5 引物 B 10 mol/L 6 样品对 照 Vero Vero 7 操作步 骤 7.1 样品的 采集 与处 理。7.1.1 采集工 具 121 2 20 min a)b)c)d)1.5 mL e)7.1.2 粪便采 集 1.0 mL PBS A A.5 1.5 mL 7.1.3 胃或肠 及 内 容物 的采 集 7.1.4 样品储 运 DB13/T 2404 2016 3 24 h 7.1.5 样品的 处理 7.1.5.1 棉拭子 处理 方法 4 3000 r/min 15 min 1.5 mL 7.1.5.2 胃或肠 及内 容物 的处 理方 法 1:1 4 3000 r/min 15 min 1.5 mL 7.2 RNA 的 提取 7.2.1 LS TRIzol RNA 7.2.2 250 L 750 L TRIzol LS Reagent 2 min 5 min 7.2.3 250 L 1 min 5 min 4 12000 r/min 15 min 7.2.4 15 min 4 12000 r/min 15 min 7.2.5 DEPC 75%700 L 800 L 4 12000 r/min 5 min 7.2.6 50 DEPC 7.2.7 RNA 2 h RT-PCR-80 7.2.8 RNA RNA 7.3 RT-PCR 7.3.1 反转 录 反应（cDNA 的合 成）RNA 11 L 2 L 10 mol/L 4 L 5 0.5 L 0.5 L RNA 2 L dNTP Mixture 20 L 42 1 h cDNA PCR-20 7.3.2 PCR 反应 8 L 10 L 1 L cDNA 0.5 L 10 0.5 L 20 L DB13/T 2404 2016 4 PCR 94 3 min 94 10 s 55 30 s 72 25 s 3072 5 min 4 8 扩增产 物的 电泳 检测 1.0%1 TAE 3 L 5 L 110V 30 min 40 min 9 实验成 立的 描述 10 结果判 定 RT-PCR 477 bp RT-PCR C C.1 RT-PCR 477 bp DB13/T 2404 2016 5 附录A（规范 性附 录）相关试 剂的 配制 A.1 1.0%琼脂 糖凝 胶 1.0 g 100 mL 1 TAE 60 5 L 3 mm 5 mm A.2 50 TAE 电泳 缓冲 液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶 液（pH 8.0）EDTA 18.61 g 100 mL pH 8.0 A.2.2 TAE 电 泳缓 冲液（50）Tris 242 g 57.1 mL 0.5 mol/L EDTA 100 mL 1000 mL A.3 溴化 乙锭（EB）溶 液 20 mg 20 mL A.4 DEPC 水 DEPC 50 L 100 mL 6 h-8 h 121 2 20 min 1.5 mL DEPC A.5 PBS 缓冲 液 A.5.1 A 0.2 mol/L NaH2PO4 H2O 27.6 g 1000 mL A.5.2 B 0.2 mol/L Na2HPO4 7H2O 53.6 g Na2HPO4 127H2O 71.6 g Na2HPO4 2H2O 35.6 g 1000 mL A.5.3 0.01 mol/L pH7.2.A 14 mL B 36 mL NaCl 8.5 g 1000 mL DB13/T 2404 2016 6 附录 B（规范 性附 录）引 物 B.1 表B.1 mol/L 5-3 10 ACG GGT GCC ATT ATC CCT CTA T 10 GAC TGG TTG TTG CCT CTG TTG T DB13/T 2404 2016 7 附录 C（规范 性附 录）猪流行 性腹 泻病 毒 RT-PCR 产物电 泳图 RT-PCR C.1 M-DNA 100 bp 1-2-图C.1 猪流 行性 腹泻 病 毒 RT-PCR 产物 电泳 图 _