ICS 65.120 B 46 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1594 2019 青贮饲料 中微生物 数量测定 方法 Code for measuring microorganism counts in silage 2019-02-20 发布 2019-05-20 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1594 2019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 方法.2 5 仪 器设 备.2 6 培 养基 和试 剂.2 7 测 定程 序.3 8 分 析步 骤.3 9 微 生物 数量 计算.3 附录A（资 料性 附录）培养基.4 DB15/T 1594 2019 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由内 蒙古 自治 区农 牧业科 学院 提出。本标准 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC19）归口。本标准 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院、内 蒙古农 业大 学、中国 农业 科学院 草原 研究 所、沈阳农业 大学、内 蒙古 草都 饲草料 研究 院、内蒙 古自 治区草 原勘 察规 划院。本标准 主要 起草 人：孙林、薛 艳林、格根 图、张 福 金、殷国 梅、孙 杰、赵 和 平、孙娟 娟、白 春生、王志军、羿 静、张欣 昕、刘广华、范 文强、张 园园、刘思 博、张琼 琳。DB15/T 1594 2019 1 青贮饲料 中微生 物数量测 定方法 1 范围 本标准 规定 了青 贮饲 料中 乳酸菌、大 肠杆 菌、细菌、霉菌 和酵 母菌 数量 测定 的方法、仪 器设 备、培养基和 试剂、测 定程 序、分析步 骤、数量 计算。本标准 适用 于内 蒙古 地区 青贮饲 料中 微生 物数 量测 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 术语和 定义 3.1 青贮饲 料微 生物 microorganism in silage 青贮饲 料中 的乳 酸菌、大 肠杆菌、细 菌、霉菌 和酵 母菌等 微生 物。3.2 乳酸菌 数量 lactic acid bacteria count 青贮饲 料样 品经 过处 理，在一定 的培 养成 分、温度 和时间 下培 养后，所 得 1 g 试样中 所含 乳酸 菌数量。3.3 大肠杆 菌数 量 coliform bacteria count 青贮饲 料样品 经过 处理，在一定 的培养 成分、温度 和时间 下培养 后，所得1 g 试样中 所含 大 肠杆 菌的数量。3.4 细菌数 量 bacteria count 青贮饲 料样品 经过 处理，在一定 的培养 成分、温度 和时间 下培养 后，所得1 g 试样中 所含好 氧细 菌数量。DB15/T 1594 2019 2 3.5 霉菌数 量 moulds count 青贮饲 料样 品经 过处 理，在一定 的培 养成 分、温度 和时间 下培 养后，所 得1 g 试样中 含霉 菌数 量。3.6 酵母菌 数量 yeasts count 青贮饲 料样 品经 过处 理，在一定 的培 养成 分、温度 和时间 下培 养后，所 得1 g 试样中 含酵 母菌 数 量。3.7 菌落形 成单 位 colony-forming units，CFU 在琼脂 平板 上经 过一 定温 度和时 间培 养后 形成 的每 一个菌 落，是计 算微 生物 数量的 单位。4 方法 根据青 贮饲 料中 微生 物生 理特性，选 择分 别适 宜于 真菌、细菌、大 肠杆 菌和 乳酸菌 生长 的培 养基，采用平 板计 数方 法，测定 微生物 数量。5 仪器设 备 5.1 分析天 平，感 量0.001 g。5.2 恒温培 养箱：36 1。5.3 高压灭 菌器：灭 菌压 力 0-3 kg/cm2。5.4 振荡器：往 复式。5.5 涡旋震 荡器：2900 r/min。5.6 灭菌玻 璃三 角瓶：250 mL，500 mL。5.7 灭菌试 管：15 mm 150 mm。5.8 灭菌培 养皿：直 径90 mm。5.9 灭菌吸 管：1 mL，10 mL。5.10 灭菌玻 璃珠：直 径5 mm。5.11 水浴锅：（4577）1。5.12 超净工 作台。6 培养基 和试 剂 6.1 乳酸菌 培养 基：MRS 琼脂，见附 件 A.1。6.2 大肠杆 菌培 养基：结 晶紫 中性红 胆盐 琼脂，见 附 件A.2。6.3 细菌培 养基：营 养琼 脂，见附 件 A.3。6.4 霉菌培 养基：马 铃薯 葡萄 糖琼脂，见 附 件A.4。6.5 酵母菌 培养 基：马铃 薯葡 萄糖琼 脂，见附 件A.4。6.6 稀释液：称 取氯 化 钠8.5 g，溶 于1000 mL 蒸 馏水 中，分装 后，121 高 压灭 菌 30 min。6.7 除特殊 注明，所 用试 剂均 为分析 纯；水符 合GB/T 6682 三 级水 规格。DB15/T 1594 2019 3 6.8 实验 室 常用 消毒 试剂。7 测定程 序 青贮饲 料微 生物 数量 测定 程序图 见图1。图1 青贮饲 料微 生物 数量 测定 程序图 8 分析步 骤 8.1 按照GB/T 14699.1 中的 规 定执行，采 样时 注意 样品 的代表 性和 避免 污染。8.2 菌液制 备 以无 菌操 作称 取 25 g 青 贮样品 放入 装 有225 mL 灭菌 稀释 液的 玻璃 三角瓶 中，封口 后置振荡器 上，振 荡30 min，即为 1:10 的菌 液。8.3 用灭菌 吸管 吸 取1:10 菌液 10 mL，注入 灭菌 试管 中，置 涡旋 震荡 器上 混 合3 min，使 微生 物充 分分散成 单个 细胞。8.4 用灭菌 吸管 吸 取8.3 的菌 液（1:10）1 mL，注 入含 有 9 mL 灭 菌稀释 液试 管中，置涡 旋震 荡器 上 混合 1 min，此液 为1:100 菌液。8.5 按照上 述操 作顺 序 作 10 倍 递增稀 释，每 稀释 一次，换用一 支1mL 灭 菌吸 管；根据对 样品 情况 的估计，选 择三 个合 适稀 释度；吸 取 1 mL 所 选稀 释度 菌 液于灭 菌培 养皿 中，每个 稀释度 作两 个培 养皿。8.6 菌液移 入培 养皿 后，应及 时将 至 45 至 60 的 培养基 注入 培养 皿 约15 mL 并转 动培 养皿 使混合均匀。8.7 待培养 基凝 固后，翻 转培 养皿，倒置 于恒 温（乳 酸 菌：30 厌 氧，大肠杆 菌、细菌、霉菌 和酵 母菌：30）培 养箱 中，培 养 24 h 至96 h（乳 酸菌：72 h，霉 菌 和 酵母 菌：96 h，大肠 杆菌：24 h，细菌：96 h）后 开始 观测 计数。8.8 选取乳 酸菌、大 肠杆 菌、细菌或 酵母 菌等 菌落 数 在30 CFU 300 CFU 之 间的 培养皿 进行 计数，选取霉菌 菌落 数 在10 CFU 100 CFU 之间 的培 养皿 进行 计数；每个 稀释 度的 菌落 数应采 用两 个平 板的 平均数。9 微生物 数量 计算 青贮饲 料中 乳酸 菌、大肠 杆菌、细菌、霉 菌和 酵母 菌数量 按公 式（1）计算：N=(C10 n-1250)/25（1）式中:N 每克 青贮 饲料 中微 生 物数量，单 位为CFU/g；C 相同 稀释 度两 个培 养 皿上菌 落数 的平 均值；n 稀释 度。DB15/T 1594 2019 4 A A 附 录 A（资料 性附 录）培养基 A.1 MRS琼脂 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温80 1.0 mL K2HPO4 7 H2O 2.0 g 醋酸钠3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO4 7 H2O 0.2 g MnSO4 4 H2O 0.05 g 琼脂粉 15.0 g A.1.2 制法 将上述 成分 加入 到1000 mL 蒸馏水 中，加热 溶解，调节pH至6.2 0.2，分装 后121 高压 灭菌15 min。A.2 结晶紫 中性 红胆 盐琼 脂 A.2.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏粉 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 3 号胆盐 1.5 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15.0 g A.2.2 制法 将上述 成分 加入 到1000 mL 蒸馏水 中，煮沸 不要 超过2 min，调节pH至pH 7.4 0.2。DB15/T 1594 2019 5 A.3 营养琼 脂 A.3.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g A.3.2 制法 将上述 成分加 入到1000 mL 蒸馏水 中，加 热溶解，调 节pH至7.3 0.1，分装 后121 高压 灭菌15 min。A.4 马铃薯 葡萄 糖琼 脂 A.4.1 成分 马铃薯 200.0 g 葡萄糖 20.0 g 琼脂 20.0 g A.4.2 制法 将上述 成分 加入 到1000 mL 蒸馏水 中，加热 溶解，分 装后121 高压 灭菌15 min。_