ICS 67.040 X 00 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 29992017 动物尿液中FB1的测定柱前衍生高效液相色谱法 Determination of FB1 in animal urineHigh performance liquid chromatographic method with pre-column derivatization 文稿版次选择 2017-12-30发布 2018-01-30实施安徽省质量技术监督局发布 DB34/T 29992017 I 前言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省农业科学院、阜阳市动物卫生监督所、安徽浩翔农牧有限公司。本标准起草人：王希春、吴金节、汤继顺、谢玉洁、高亚飞、冯士彬、李玉、李锦春、李郁、孙裴。DB34/T 29992017 1 动物尿液中FB1的测定-柱前衍生高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了动物尿液中 FB1 柱前衍生高效液相色谱法测定的原理、试剂和设备、分析步骤、分析结果的表述、重复性、检出限与定量限、回收率。本标准适用于动物尿液中 FB1 的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 样品经过离心处理，取上清液过免疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的 FB1 经过邻苯二甲醛衍生后进高效液相色谱柱分离，荧光检测，外标法定量。4 试剂和设备 4.1 试剂 4.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.1.2 乙酸（CH3COOH）。4.1.3 氢氧化钾（KOH）。4.1.4 氯化钠（NaCl）。4.1.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。4.1.6 磷酸二氢钾（KH2PO4）。4.1.7 硼酸（H3BO3）。4.1.8 2-巯基乙醇（C2H6OS）。4.1.9 邻苯二甲醛（OPA，C8H6O2）。4.1.10 磷酸二氢钠（NaH2PO4）。4.2 设备 4.2.1 高效液相色谱仪，带荧光检测器。4.2.2 振荡器。4.2.3 微量进样器。4.2.4 天平：感量 0.0001 g。4.2.5 pH 计。DB34/T 29992017 2 4.2.6 氮吹仪。4.2.7 超低温冰箱。4.2.8 离心机：转速 4000 r/min。4.2.9 免疫亲和柱（柱容量 5000 ng，FB1柱回收率 80）。4.2.10 微孔滤膜：0.22 m，有机型。5 分析步骤 5.1 样品制备 取新鲜的或完全溶解的冻存尿液 510 mL，在 4000 r/m 离心 5 min，上清液转移至另一离心管中。5.2 试样净化 先用 10 mL PBS 缓冲液淋洗免疫亲和柱，自然流出，加入 5 mL 尿液上清液，再用 10 mL PBS 缓冲液淋洗免疫亲和柱，然后用 1 mL 甲醇-乙酸溶液（附录A.1.4）洗脱免疫亲和柱三次，收集洗脱液，55下氮吹至干，加入 500 L 甲醇-水溶液（附录A.1.2）溶解残渣。涡旋 30 s，过 0.22 m 微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。注：由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同，实际操作时，请参照厂商提供的操作说明和程序使用。5.3 衍生 取 100 L 标准溶液或样品溶液于进样瓶中，加入 100 L 衍生溶液（附录A.1.8），涡旋混合 30 s，在 2 min 内进样分析。5.4 仪器参考条件 色谱柱：C18 柱，250 mm4.6 mm，5 m 或相当者。检测波长：激发波长 330 nm，发射波长 440 nm。流动相：A：磷酸二氢钠溶液（附录A.1.1）；B：甲醇。梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速：1.0 mL/min。柱温：35。进样量：100 L。表1 流动相洗脱程序 时间 min 流动相 A 流动相 B 0.00 35.0 65.0 13.00 20.0 80.0 5.5 试样溶液的测定 在 5.4 色谱条件下，将 100.0 L FB1 标准工作溶液（附录A.2.2）按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪；FB1 标准品色谱图参考附录B，待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标（x 轴），目标物质的峰面积为纵坐标（y 轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线见公式（1）：DB34/T 29992017 3 y=ax-b.(1)式中：y 目标物质的峰面积比；a 回归曲线的斜率；x 目标物质的浓度；b 回归曲线的截距。标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样本含量超过标准曲线范围，需稀释后再测定。5.6 空白试验 不加入试样，按 5.2 和 5.3 的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。6 分析结果的表述 样品分析见公式（2）：X=mf V ci.(2)式中：X 待测样本中FB1的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；ci 待测物进样液中FB1的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；f 试液稀释倍数；m 样本的取样量，单位为毫升（mL）。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。7 重复性 尿液样本中 FB1 含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10。8 检出限与定量限 本方法中尿液 FB1 的最低检出限为 0.2 ng/mL，定量限为 2 ng/mL。9 回收率 添加浓度在 2 ng/mL10 ng/mL 时，回收率在 79.889.8之间。DB34/T 29992017 4 A A 附 录 A（规范性附录）溶液 A.1 溶液配制 A.1.1 磷酸二氢钠溶液（0.1 mol/L，pH：3.3）：精密称定 12 g 无水磷酸二氢钠，溶于 980 mL 水中，用磷酸调 pH 至 3.4，用水稀释至 1000 mL，混合均匀。A.1.2 甲醇-水溶液（50+50）：分别量取 500 mL 甲醇和 500 mL 水，混合均匀。A.1.3 甲醇-水溶液（20+80）：分别量取 200 mL 甲醇和 800 mL 水，混合均匀。A.1.4 甲醇-乙酸溶液（98+2）：吸取 2 mL 乙酸，加入到 98 mL 甲醇中，混合均匀。A.1.5 氢氧化钠（1 mol/L）溶液：精密称定氢氧化钠 4.0 g，溶于 100 mL 水，混合均匀。A.1.6 磷酸盐缓冲液（PBS）：精密称定 8.0 g 氯化钠、1.2 g 磷酸氢二钠、0.2 g 磷酸二氢钾、0.2 g 氯化钾，用 980 mL 水溶解，然后用盐酸调整 pH 至 7.4，最后用水稀释至 1000 mL，混合均匀。A.1.7 硼酸溶液（3）：精密称定硼酸 3.093 g，用水溶解并稀释至 100 mL，用氢氧化钾调整 pH 至 10.5，混合均匀。A.1.8 衍生溶液：精密称定 36 mg 邻苯二甲醛，溶于 250 L 甲醇，加入 72 L 2-巯基乙醇，用硼酸溶液（3）（A.1.7）6 mL 稀释，混合均匀，4避光保存。A.1.9 实验室用水应符合 GB/T 6682 的规定。A.2 FB1标准溶液配制 A.2.1 标准储备溶液（0.1 mg/mL）：精密称定 FB1 标准品（纯度 95）0.01 g（精确至 0.0001 g）至小烧杯中，用甲醇-水溶液（A.1.2）溶解，并转移至 100 mL 容量瓶中，定容至刻度。此溶液密封后-20避光保存。有效期 6 个月。A.2.2 标准工作液：准确吸取标准溶液，用甲醇-水溶液（A.1.3）稀释，配制成 FB1 浓度依次为 2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 的标准工作溶液。DB34/T 29992017 5 B B 附 录 B（资料性附录）FB1标准品的液相色谱图 图B.1 FB1标准品色谱图 _