ICS 67.050 B 04 备案号：35747-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1619 2011 牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of Clenbuterol residue in the cow urine HPLC-MS/MS method 2012-12-01发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1619 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：马书民、张勋、赵庆松、杨璐、胡婷婷、康明芹、王明泰、荣会。DB22/T 1619 2012 1 牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了牛尿中盐酸克伦特罗残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用于牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的 引 用文件，仅所 注日期的 版 本适用于本文 件。凡是不注日期的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法。3 原理 本方法 采 用 高氯 酸 溶 液 沉淀蛋白，氢氧化钠溶 液 调节 pH值后，用 乙 酸 乙酯萃取，样 液 经浓缩后过混合型阳离子交换固 相 萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱 仪 测定，外 标法定量。4 试剂与材料 除另有说 明 外，所 用 试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的 一级水。4.1 盐酸克伦特罗标准 物 质（CAS：37148-27-9）：纯度 98.5。4.2 乙腈：色谱 纯。4.3 乙 酸 乙酯：色谱 纯。4.4 甲醇：色谱 纯。4.5 甲 酸：色谱 纯。4.6 高氯 酸：含 量 为 70%72%。4.7 氨水:含 量 为 25%28%。4.8 氢氧化钠。4.9 0.1 mol/L高氯 酸 溶 液：0.83 mL高氯 酸 溶解 于 100 mL水 中，混匀备 用。4.10 1 mol/L氢氧化钠溶 液：称取 4g NaOH，溶 于 100mL水 中，混匀备 用。4.11 0.1%甲 酸 溶 液：准 确吸取 1 mL甲 酸（4.5），用 水 定 容至 1 L，混匀后备 用。4.12 50%甲醇溶 液（50+50）：50 mL甲醇（4.4）与 50 mL水混匀。4.13 5%氨化甲醇（95+5）：95 mL甲醇（4.4）与 5 mL氨水（4.7）混匀。4.14 标准 储备溶 液：准 确称取 适量的标准 品，用 甲醇(4.4)配制成 100.0 mg/L的标准 贮备 液，在 0 4 冰箱 中 保存。4.15 标准 工作 溶 液：根据需 要用 甲醇(4.4)稀释 配制 适 当 浓度 的标准 工作 液，现 用 现 配。4.16 有 机 相 微孔滤膜：0.22 m。DB22/T 1619 2012 2 4.17 混合型阳离子交换固 相 萃取柱（MCX固 相 萃取柱）：60 mg/3 mL。使 用 前依次 用 3 mL甲醇、3 mL水 活 化。5 仪器与设备 5.1 液相色谱-质谱/质谱 仪：配备 电喷雾 离子 源（ESI）。5.2 氮吹 仪。5.3 旋转蒸发器。5.4 天平：感 量 0.0001 g和 0.01 g。5.5 涡旋 混合 器。5.6 离 心 机：转速大 于 7000 r/min。6 分析步骤 6.1 提取 取 5 mL样品（精 确 到 0.1 mL）于 50 mL离 心 管 中，加 入 5 mL高氯 酸 溶 液（4.9）于 涡旋 混合 器上 充 分混合，用 1 mol/L NaOH溶 液 调节溶 液的 pH值至 9.5 0.1，加 入 20 mL乙 酸 乙酯，涡旋振荡 混匀。4 条 件下 10000 r/min离 心 5 min，重复 提 取 三次，合 并 乙 酸 乙酯 相，放 入 浓缩 瓶 中，35 旋 至 近干，用 5 mL 0.1%甲 酸 溶 液(4.11)定 容，待 净化。6.2 净化 将上述 样 液 过 MCX柱净化，依次 用 5 mL甲醇（4.4）、5 mL水 和 5 mL 0.1%甲 酸 水溶 液(4.11)对 柱子 进行预处理，将 样品溶解 液 以 1.0 mL/min的 流速加载 在 MCX（4.17）小 柱 上，再依次 用 5 mL 0.1%甲 酸 溶液、5 mL水、5 mL50%甲醇(4.12)洗 柱，弃去淋洗 液；真空抽干 MCX柱 2 min，用 5 mL5%氨化甲醇（4.13）进行洗脱，收集洗脱 液。洗脱 液 在 45 下 氮气流吹干，加 入 1 mL乙腈：0.1%甲 酸 溶 液（30:70）溶解 残渣，过 0.22 m滤膜，进行 HPLC-MS/MS测定 分析。6.3 空白试验 除 不 称取试样外，均 按 6.1和 6.2进行。6.4 测定 6.4.1 色谱参考条件 色谱 参考条 件 如 下：a)色谱 柱：C18柱，150 mm 2.1 mm(i.d)，3.5 m或 相 当者；b)流动 相：乙腈-0.1%甲 酸 水（30+70）；c)流速：0.20 mL/min；d)柱 温：30；e)进 样 量：10 L。6.4.2 质谱参考条件 质谱 参考条 件 如 下：a)离子 源：电喷雾 离子 源（ESI）；DB22/T 1619 2012 3 b)扫描 方 式：正 离子 扫描，检测方 式：多反 应 监 测（MRM）；c)电 离 电 压：3 kV 5 kV；d)离子 源温 度：300 550；e)脱 溶剂 气：0.21 MPa；f)雾 化 气：0.31 MPa；g)辅助 气：0.31 MPa；h)定 性 离子 对、定量 离子 对、去 簇 电 压、碰撞能 量 见表 1。表 1 盐酸克伦特罗选择监测离子(m/z)、碰撞气能量及去簇电压参数 名 称 定量 离子 对 定 性 离子 对 碰撞 气 能 量（eV）去 簇 电 压(V)盐酸克伦特罗 277.0 203.0 411.2 203.0 411.2 259.0 25 25 50 6.4.3 定性分析 在 同 一 色谱/质谱 条 件下 进行 标准 溶 液和 样品溶 液的测定，如 果 样品溶 液中检出的色谱 峰 的 保 留 时间 与 标准 物 质色谱 峰 的 保 留 时间 一 致，所 选择 的 两 对 子离子 的质 荷比也 一 致，而且 样品 定 性 离子 的相对 丰 度与浓度 相 当 标准 工作 溶 液的定 性 离子 的相对 丰 度 相 比较，相对标准 偏差 不 超 过 表 2规定的 范围，则可 判 定 样品 中 存 在 该 物 质。标准 物 质 多反 应 监 测色谱 图 参 见附录 A。表 2 定性确定时相对离子丰 度 的 最大允许偏差 相对 离子 丰 度 50%20%至 50%10%至 20%10%允许 的相对 偏差 20%25%30%50%6.4.4 定量测定 根据 试样 中 被 测 样 液中 被 测 组 分 的 含 量 情况，选 取 响 应 值 相 近 的标准 工作 液 进行 分析，对于 高浓度 样品 须 适 当进行 系 列 稀释。标准 工作 液和 样 液中 被 测 组 分 的 响 应 值均 应 在仪 器 线性响 应 范围内。在 上述 色谱 条 件下，盐酸克伦特罗的 参考保 留 时间 为 4.71 min。7 结果计算和 表 述 按 式（1）计算 试样 中盐酸克伦特罗残留量：Vv cX=.(1)式 中：X 试样 中 被 测 物含 量，单位 为 微 克 每升，g/L；c 从 标准 曲线读 出的 被 测 物浓度，单位 为 微 克 每毫升，ng/mL；v 样 液 最 终 定 容 体积，单位 为 毫升，mL；V 样 液 所 代表 的 最 终 试样 的 体积，单位 为 毫升，mL。计算结果表示 到小 数点 后 两 位。8 定量 限、回收率和精密度 DB22/T 1619 2012 4 8.1 定量 限 本方法的定量 限 为 0.10 g/L。8.2 回收率 及 精密度 在 重复 性 条 件下 获得 的 两 次 独立 测 试 结果 的 绝 对 差 值 不 大 于 这两个 测定 结果 的 算 术 平 均值 的 15%。样品 中盐酸克伦特罗的 添 加 浓度 及 其 回 收 率、精 密 度实 验 数 据参 见附录 B。DB22/T 1619 2012 5 附 录 A（资 料性 附录）盐酸克伦特罗的 多反应 监测色谱 图 图 A.1 盐酸克伦特罗标准 品 的 多反应 监测色谱 图（0.10 ug/L）A DB22/T 1619 2012 6 B B 附 录 B（资 料性 附录）不同添加水平平均回收率 及 精密度（n=10）表 B.1 盐酸克伦特罗的 添加回收率和精密度 添 加 浓度 范围（0.10 1.0 ug/L）样品 回 收 率范围（%）相对标准 偏差（%）牛尿 84.0 101.6 2.4 2.6 _