ICS 65.020 B 05 备案号：35077-2012 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1589 2012 高粱品种鉴定 DNA指纹法（SSR）Identification of sorghum(Sorghum bicolor(L.)Moench)varieties using DNA fingerprinting method(SSR)2012-09-15发布 2012-10-31实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1589 2012 I 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省农业科学院农业部植物新品种测试(公主岭)分中心、农业生物技术研究所。本标准主要起草人：李晓辉，王凤华，张春宵，周海涛，郝彩环，王威，侯佳明，王晶。DB22/T 1589 2012 1 高粱品种鉴定 DNA指纹法（SSR）1 范围 本标准规定了利用简单重复序列（SSR,simple sequence repeat）分子标记进行高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)品种 DNA指纹 鉴 定的试 验方法、数据采集、结果 记 录及判 定标准。本标准 适 用 于 高粱 各类材料 的 DNA分子 数据采集 和品种 鉴 定。2 规范性引用文件 下 列 文件对于 本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅注日期 的 版 本 适 用 于 本 文件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最 新 版 本（包括 所 有 的 修改 单）适 用 于 本 文件。GB/T 3543.2 农 作 物种子 检验 规 程 扦样 GB/T 6682 分 析实验室 用 水 规 格 和试 验方法 GB/T 19557.1 植物新品种 特异性、一致性 和 稳 定 性 测试指 南 总 则 3 术语和定义 下 列术 语 和定 义适 用 于 本 文件。3.1 核心引物 core primer 多态性、稳 定 性、重复 性等综合特性好，可作为 DNA指纹 鉴 定 优先选 用的 一套 SSR引 物，包括基 本 核心 引 物和 扩展核 心 引 物。基 本 核 心 引 物 是 用 于 品种 建库 和 鉴 定，并 且保证不同实验室数据具有可比性，可 进行 数据整合 的 一套统一固 定 引 物。扩展核 心 引 物 是可根据引 物的 最 新研究 结果 和 特殊鉴 定 性状 进行 调整 的 一套相对固 定的 引 物。3.2 参照品种 reference cultivar 用 于确 定 等 位 变异，校正仪器设备 的 系 统 误差,对应于特 定 SSR位 点上大小已知 的 不同等 位 变异 的 一组 品种。4 原理 从 高粱种子、幼苗、叶片 等 组织 中提 取 DNA，利用 普通或荧光染 料 标记的 SSR引 物进行 PCR扩 增。不同 长度 的 PCR扩 增片段通过 变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分 离，经硝酸银染色或者荧光染 料 标记 检 测 区 分开来。不同 高粱品种由 于 遗传组成 不同，在 基 因组 DNA的 多 个 SSR位 点 中，一 些 位 点 的简单重复序列的 重复 次 数有 差 异，这 种 差 异可 通过 变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳区 分，从而 对不同 品种进行 区 分 鉴 定。DB22/T 1589 2012 2 5 试剂与材料 除另 有 说 明 外，在 分 析 中 仅 使 用 确 认 为 分 析 纯 的试 剂 和 GB/T 6682规定的 一 级 水。5.1 试剂 5.1.1 十六烷 基 三乙 基 溴化铵（CTAB:C16H33(CH3)3NBr）。5.1.2 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2 2H2O:C10H14N2Na2O8 2H2O）。5.1.3 三羟甲 基 氨 基 甲烷（tris-base:C4H11NO3）。5.1.4 氢氧化钠（NaOH）。5.1.5 氯化钠（NaCl）。5.1.6 琼脂糖（agarose）。5.1.7 溴酚蓝（brph blue:C19H10Br4O5S）。5.1.8 二甲苯青 FF（C25H27N2O6S2Na）。5.1.9 甲 叉双 丙烯酰胺（bisacrylamide:(H2C=CHCONH)2CH2）。5.1.10 丙烯酰胺（C3H5NO）。5.1.11 硼 酸（boric Acid:H3BO3）。5.1.12 尿素（CH4N2O）。5.1.13 过 硫 酸铵（APS:(NH4)2S2O8）。5.1.14 乙酸铵（CH3COONH4）。5.1.15 硝酸银（AgNO3）。5.1.16 三氯甲烷（CHCl3）。5.1.17 异 丙 醇（C3H8O）。5.1.18 异 戊醇（C5H12O）。5.1.19 盐 酸（HCl）：37%。5.1.20 10 Buffer缓冲液:含 Mg2+25 mmol/L。5.1.21 四 种 脱 氧 核 苷 三 磷 酸:dATP、dTTP、dGTP、dCTP（10 mmol/L each）。5.1.22 Taq DNA聚 合 酶：2 U/mL。5.1.23 矿 物 油。5.1.24 去 离 子 甲酰胺（formamide:HCONH）。5.1.25 亲 和 硅 烷（binding silane）:97%。5.1.26 剥 离 硅 烷（repel silane）:2%二甲 基 二氯 硅 烷（C2H6Cl2Si）。5.1.27 无 水 乙 醇（C2H6O）。5.1.28 四甲 基 乙二胺（TEMED:C6H16N2）。5.1.29 冰醋 酸（C2H4O2）。5.1.30 甲 醛溶液（CH2O）:37%。5.1.31 DNA分子 量 标准:DL2000。5.1.32 核 酸染色剂。5.1.33 DNA分 析 仪 专 用 丙烯酰胺胶 液。5.1.34 DNA分 析 仪 专 用 电泳 缓冲液。5.1.35 DNA分 析 仪 专 用分子 量内 标 Liz标记。5.1.36 DNA分 析 仪 专 用 光 谱 校 准 基 质，6-FAM荧光 标记的 DNA片段。5.2 试剂配制 DB22/T 1589 2012 3 5.2.1 DNA提取试剂的配制 5.2.1.1 EDTA溶液（0.5 mol/L）186.1 g EDTA-Na2 2H2O溶 于 800 mL水 中，用 NaOH调 pH值至 8.0，定 容至 1000 mL，103.4 kPa灭菌。5.2.1.2 Tris-HCl溶液（1 mol/L）60.55 g Tris-base溶 于适 量 水 中，加 HCl调 pH至 8.0，定 容至 500 mL，103.4 kPa灭菌。5.2.1.3 HCl溶液（0.5 mol/L）25 mL浓盐 酸(36%-38%)，加 水 定 容至 500 mL。5.2.1.4 NaCl溶液（5 mol/L）292.5 g NaCl+ddH2O至终体积 1000 mL，103.4 kPa灭菌。5.2.1.5 DNA提取 CTAB缓冲液 1 mol/L Tris-HCl 83.5 mL，5 mol/L NaCL 235 mL，0.5 mol/L EDTA 33.4 mL，CTAB固 体 20 g，定 容至 1000 mL。5.2.1.6 氯仿-异戊醇(24:1)按 24:1的 比 例（体积 比）配制混 合 液。5.2.1.7 76%乙醇 无 水 乙 醇 380 mL，定 容至 500 mL。5.2.1.8 TE缓冲液 1 mol/L Tris-HCl 5 mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，加 HCl调 pH至 8.0，定 容至 500 mL。5.2.2 dNTP的配制 用 超 纯 水 分 别配制 A、G、C、T终浓 度 100 mmol/L的 储存液。各 取 20 L混 合，用 超 纯 水 120 L定 容至每 种 核 苷 三 磷 酸 终浓 度 为 10 mmol/L的 工 作 液。103.4 kPa灭菌，-20 保 存。5.2.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制 5.2.3.1 40%PAGE胶 190 g丙烯酰胺 和 10 g甲 叉双 丙烯酰胺，定 容至 500 mL，混匀。4 贮存 备 用。5.2.3.2 6%PAGE胶 尿素 450 g，10 BTE缓冲液 100 mL，40%PAGE胶 150 mL，定 容至 1000 mL。5.2.3.3 亲和硅烷工作液 250 L冰醋 酸，250 L亲 和 硅 烷，加无 水 乙 醇至 50 mL，混匀。分 装 于 1.5 mL Eppendorf管 中。4 贮存 备 用。5.2.3.4 剥离硅烷工作液 DB22/T 1589 2012 4 2%二甲 基 二氯 硅 烷。5.2.3.5 25%过硫酸铵溶液 0.25 g过 硫 酸铵 溶 于 1 mL超 纯 水 中，混匀。5.2.3.6 10 TBE缓冲液 Tris-base 108 g，硼 酸 55 g，EDTA-Na2 2H2O 7.44 g，定 容至 1 L。5.2.3.7 1TBE缓冲液 10 TBE缓冲液 500 mL，加 水 定 容至 5 L。5.2.3.8 6加样缓冲液 去 离 子 甲酰胺（用 于 DNA变性）49 mL，0.5 mmol/L EDTA 1 mL，溴酚 兰 0.125 g，二甲苯青 0.125 g。5.2.4 银染 试剂的配制 5.2.4.1 固 定液 200 mL冰醋 酸，加 水 定 容至 2000 mL。5.2.4.2 染色 液 3 g硝酸银，加 水 定 容至 2000 mL。5.2.4.3 显影 液 2000 mL蒸馏 水 中 加入 25 g氢氧化钠 和 7 mL甲 醛。注 1：银染 溶液 的 配制 可 使 用 符 合 GB/T 6682规定的 三级 水。注 2：同样 标准的试 剂 盒 可 代替 上 述 试 剂。6 仪器设 备 6.1 DNA分 析 仪：基于 毛细管 电泳，有 片段 分 析 功能 和 数据 分 析 软 件，能够 分 辨 1个 核 苷 酸大小 的 差异。6.2 紫 外 分 光光度 计：波 长 260 nm 及 280 nm。6.3 酸度 计。6.4 电 子 天平：感 应为 0.01 g、0.001 g。6.5 凝胶成 像 系 统 或 紫 外 透射 仪。6.6 PCR扩 增仪。6.7 高 压 电泳仪：规 格为 3000 V、400 mA、400 W，具有 恒 电 压、恒 电 流 和 恒功率功能。6.8 垂直 电泳 槽 及 配 套 的 制 胶 附 件。6.9 普通电泳仪。6.10 水 平 电泳 槽 及 配 套 的 制 胶 附 件。6.11 高 速冷冻 离 心 机：最 大离 心 力 不 小 于 15,000 rpm。6.12 水 平 摇床。6.13 胶片 观察灯。DB22/T 1589 2012 5 6.14 微 量 移 液 器：规 格 分 别 为 10 mL、20 mL、100 mL、200 mL、1000 mL，连续 可调。6.15 磁力搅拌 器。6.16 微 波 炉。6.17 高 压灭菌 锅。6.18 水 浴锅 或 金属浴：控温精 度 1。6.19 冰 箱：最 低温 度-20。6.20 制冰机。7 SSR引物 用 超 纯 水 分 别配制 正 向 引 物和 反向 引 物 终浓 度 均 为 20 mol/L，等 体积混 合 成 10 mol/L的 工 作 液。引 物 在 DNA分 析 仪上使 用 时，须 在正 向 引 物 5端 加入 6-FAM荧光 修 饰 基 团。引 物 清 单 见 附 录 A。8 参照品种 及其使 用 在 进行 等 位 变异检 测 时，应同 时 包括相应 参 照品种的 PCR扩 增 产 物。若 多 个 品种 在 某 一 SSR位 点上都 具有相同 的 等 位 变异。在 确 认这些 品种 该 位 点 等 位 变异 大小 与参 照品种 相同 后，这些 品种 也 可 以 代替 资 料 附 录 B中的 参 照品种 使 用。若 同一 名称 不同 来 源 的 参 照品种的 某 一 位 点上 的 等 位 变异不相同，在使 用 其 他 来 源 的 参 照品种 时，应 与原参 照品种 核对，确 认 无 误 后 使 用。对于 附 录 B中 未 包括 的 等 位 变异，应 按本标准 方法，确 定 其 大小 和 对应 参 照品种。参 照品种的 名称参见 附 录 B。9 操 作 步骤 9.1 试样制备 9.1.1 样 品 材料可为 种子、幼苗、植 株 幼 嫩 叶片 等 组织或器 官。对于 种子 样 品分 样 和 保 存，按 GB/T 3543.2的规定进行。9.1.2 每 份 样 品 随 机 取 10个个 体（种子、叶片或 其 他 等 效 物）进行分 析。9.2 DNA提取 DNA提 取 步骤如 下：a)称 取 500 mg幼苗，液 氮 下 迅 速 磨 成 粉末；b)将粉末转 入 2.0 mL Eppendorf管 中，加入 700 L 65 预热 的 CTAB缓冲液，并 使 其 混匀；c)65 水 浴 加 热 45 min，不 断地轻轻倒转摇动。水 浴后，取 出 离 心 管，冷 却 至 室 温；d)通 风橱 下 加入 700 L的 氯 仿:异 戊醇（24:1），轻轻倒转摇动 5 min 10 min；e)12000 rpm(室 温)离 心 10 min，用 去 头枪尖将 上 清转 至 一 新 2.0 mL Eppendorf管 中；f)加入 10 L RNA酶溶液（10 mg/mL），37 下 温浴 30 min；g)重复 4 5步骤；h)加入-20 预 冷 的 异 丙 醇（1倍 体积）或 无 水 乙 醇（2倍 体积）于 2.0 mL Eppendorf管 中，轻 轻 混匀。-20 冰 箱静置 一 段 时间后，至 DNA凝 集，室 温 下 钩 出 DNA；i)76%乙 醇 洗涤两 次（其 中 一 次 可 过 夜）。洗涤完毕后，将 DNA晾干；j)加入 适 量 的 1 TE(pH 8.0)溶 解 于 试 管 中，4 下保 存 备 用；k)将 DNA原 液 于 0.8%琼脂糖凝胶电泳 检 测 质量（DL2000为 Marker)。-20 下保 存 备 用。DB22/T 1589 2012 6 注 1：利用种子、幼苗、植 株 幼 嫩 叶片 等 组织或器 官 提 取 DNA均 可，但 鉴于 高粱的种子 籽粒较 小，本标准 推荐使 用 幼苗。注 2：上 述 DNA提 取 方法为 标准 推荐 使 用的，在 保证 DNA提 取 质量 的 前 提 下其 它 DNA提 取 方法 均 可采 用。注 3：杂交 种种子 应为 当 代 种子，常 规 系 及其 他 类 型 种子 应为 纯 合 种子。9.3 PCR反应体系及程序 9.3.1 反应体系 10 L的 反 应 体积，含每 种 dNTP 0.10 mmol/L，正 向、反向 引 物 各 0.24 mmol/L（利用 DNA分 析 仪 检测 时 使 用 荧光 标记 引 物），Taq DNA聚 合 酶 0.4 U，1 PCR缓冲液（含 Mg2+2.5 mmol/L），样 品 DNA 20 ng 40 ng，其 余 以 超 纯 水 补足 至 所 需 体积。如 果 PCR过 程 中 不采 用 热 盖 程 序，则 反 应 液 上 加 盖 15 L矿物 油（Sigma），以 防止 反 应 过 程 中 水 分 蒸 发。9.3.2 反应程序 94 预 变性 5 min，1个 循 环；94 变性 45 s，55 退火 45 s，72 延伸 60 s，共 36个 循 环；72 延伸 10 min，4 保 存。9.4 电泳 检测 9.4.1 普通 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测 9.4.1.1 灌 胶 板 制作 灌 胶 板 制 作 步骤如 下：a)严 格 地将 玻璃板 洗 净；b)蒸馏 水 冲 洗 并 擦 干；c)用 95%酒 精 擦拭；d)在 母板 上 均 匀 涂 2 mL 3 mL亲 和 硅 烷 工 作 液，凹 槽 板 上 涂 2 mL 3 mL剥 离 硅 烷。放 置 10 min以 上，让 其 充 分 晾干。操 作 过 程 中 防止 两 块玻璃板 相 互污 染。9.4.1.2 组装玻璃板 待玻璃板彻底 干 燥 后 组 装 电泳 板，并用 水 平 仪 调 平。9.4.1.3 灌 胶 在 50 mL 6%PAGE胶 中 加入 TEMED 65 L和 25%的 过 硫 酸铵 250 L，迅 速混匀 后 灌 胶。待 胶 液流 动到 下 部，在上 部 轻轻 插 入 梳 子，使 其 凝聚 至 少 1 h以 上。灌 胶过 程 中 防止 出 现气泡。9.4.1.4 预 电泳 在正 极 槽（下 槽）中 加入 1 TBE缓冲液 600 mL，在 负极 槽（上 槽）中 加入 0.5 TBE缓冲液 600 mL，拔 出 梳 子。80 W恒功率 预 电泳 30 min 40 min。9.4.1.5 试样制备 10 L PCR扩 增 样 品 加入 3 L 6加 样 缓冲液，混匀 后，在 94 变性 10 min，迅 速 用 冰 水 浴 冷 却，并 于-20 冰 箱 中 冷 却 10 min 以 上。9.4.1.6 电泳 DB22/T 1589 2012 7 用 移 液 器 吹吸 加 样 槽，清 除 残 胶 和 气泡，插 入 样 品 梳 子，每 一 个 加 样 孔 点 入 4 L样 品。70 W恒功率 电泳 至 上 部的指 示带（二甲苯青）达到 胶 板 的中部（45 min 50 min）。电泳 结 束 后，小 心分 开 两 块玻璃板，胶 会 紧贴 在 涂 亲 和 硅 烷 的 玻璃板 上。9.4.1.7 银染 银染 步骤如 下：a)固 定：将 凝胶 板 置 于 装 有固 定 液 的 塑 料 盒内，轻轻摇 荡 10 min；b)漂 洗：双蒸 水 漂 洗 3 min；c)染色：在 新 配 染色 液 中，轻轻摇 荡 20 min；d)漂 洗：双蒸 水 漂 洗，时间 不 超 过 10 s；e)显影：在 显影 液 中、轻轻摇 荡，直至 出 现带 纹；f)定 影：在 固 定 液 中定 影 2 min；g)漂 洗：用 1.5 L双蒸 水 漂 洗 2 min；h)干 胶：室 温 下 自然 晾干。9.4.2 DNA分析仪检测 DNA分 析 仪 检 测的 具 体 过 程 参 照 相对应 仪器 型号 的 操 作 说 明 书。10 等位 变异 数据采集 10.1 数据表示 样 品 每 个 SSR位 点 的 等 位 变异采 用 扩 增片段大小 的 形式表示。10.2 数据采集 10.2.1 普通 变性聚丙烯凝胶电泳 数据采集 将 待 测 样 品 扩 增片段 的 带型 和 迁 移 位 置与 对应 的 参 照品种进行 比 较，与 待 测 样 品 相同 的 参 照品种的 片段大小 即 为 待 测 样 品 该 引 物位 点 的 等 位 变异 大小。10.2.2 DNA分析仪数据采集 使 用 DNA分 析 仪 的 片段 分 析 软 件，读 出 每 个 位 点 每 个 样 品的 等 位 变异 片段大小 数据。通过使 用 参照品种，消 除 同 型号 不同 批 次 间 或 不同 型号 DNA分 析 仪 间 可 能存 在 的 系 统 误差。比 较 参 照品种的 等 位 变异 片段大小 数据 与 附 录 B中的 数据。如两 者 不一致，确 定 系 统 误差 的 大小。从 待 测 样 品的 等 位 变异数据 中 去 除 该 系 统 误差。10.3 结果记录 10.3.1 普通 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 结果记录 将 每 个 核 心 引 物位 点 的所 有 谱 带 按 扩 增片段从小 到 大 的 顺 序 编号，用 二 位 代 码描 述（依 次 为 01、02），对 照 参 照品种的 谱 带 确 定 待 测 样 品的 基 因 型。纯 合 位 点 的 等 位 变异数据 记 录为 X/X，其 中 X为 该 位 点 谱 带 的 代 码；杂 合 位 点 的 等 位 变异数据 记 录为 X/Y，其 中 X、Y为 该 位 点上 两 个 不同 的 谱 带。小片段在 前，大片段在 后。无 效 等 位 变异 记 录 0/0。DB22/T 1589 2012 8 示例 1：以 附 录 B中的 引 物 Txp482为 例，参 照品种 TX430在 该 核 心 引 物位 点上 仅有一 条 谱 带 03，在 该 引 物位 点 的谱 带 代 码 记 录为 0303；示例 2：以 附 录 B中的 引 物 Txp494为 例，参 照品种 TX430在 该 核 心 引 物位 点上 有 两 条 谱 带 03和 06，在 该 引 物位 点的 谱 带 代 码 记 录为 0306。10.3.2 DNA分析仪结果记录 纯 合 位 点 的 等 位 变异数据 记 录为 X/X，其 中 X为 该 位 点 等 位 变异 的 大小；杂 合 位 点 的 等 位 变异数据 记 录为 X/Y，其 中 X、Y为 该 位 点上 两 个 不同 的 等 位 变异。小片段在 前，大片段在 后。示例 1：以 附 录 B中的 引 物 Txp482为 例，参 照品种 TX430在 该 核 心 引 物位 点上 有一 个 等 位 变异，大小 为 231 bp，则 该 品种 在 该 引 物位 点上 的 等 位 变异数据 记 录为 231/231；示例 2：以 附 录 B中的 引 物 Txp494为 例，参 照品种 TX430在 该 核 心 引 物位 点上 有 两 个 等 位 变异，大小 分 别 为 203 bp、215 bp，则 该 品种 在 该 引 物位 点上 的 等 位 变异数据 记 录为 203/215。11 判 定标准 11.1 直接比较 11.1.1 对 两 个或 两 个 以 上 的品种 同 时 进行 检 测 时，先 用 附 录 A.1中 20对基 本 核 心 引 物 检 测，获得待测品种 在这些 引 物位 点 的 等 位 变异数据，利用 这些 数据 进行品种 间 比 较。品种 间 差 异 位 点 数 2，判 定为不同 品种。11.1.2 对 品种 间 差 异 位 点 数=0、1的 情况，继 续 用 附 录 A.2中 20对扩展核 心 引 物进行 检 测，利用 全 部 引 物位 点 的 等 位 变异数据 进行品种 间 比 较：a)品种 间 差 异 位 点 数 2，判 定 为不同 品种；b)品种 间 差 异 位 点 数 1，判 定 为 近似 品种；c)品种 间 差 异 位 点 数 0，判 定 为 疑 同 品种。对于 b)和 c)的 情况，按 GB/T 19557.1的规定进行 田 间 鉴 定。11.2 数据库比较 对 待 测品种进行 检 测 后 利用 其检 测 数据 和 数据库 中品种的 数据 进行 比对 时，先 用 附 录 A.1中 20对基 本 核 心 引 物 检 测，获得待 测品种 在上 述 引 物位 点 的 等 位 变异数据，利用 这些 数据 和 数据库 中品种进行 比较：品种 间 差 异 位 点 数 2，判 定 为不同 品种。对 品种 间 差 异 位 点 数=0、1的 情况，将 这些 相 近 品种 或 疑 同 品种 与 待 测品种按照 11.1.2的 方法 进行鉴 定。DB22/T 1589 2012 9 A A 附 录 A（规范性 附录）引物 清单 表 A.1 20对基本 核心引物 清单 序 号 标记 名称 染色 体 正 向 引 物（5-3）反向 引 物（5-3）1 Txp482 SBI01 ATGTGTCCAGCCATGCATAA CTCATGTAGGGGCGAGTGTC 2 Gpsb089 SBI01 ATCAGGTACAGCAGGTAGG ATGCATCATGGCTGGT 3 Cup26 SBI02 CGATCATCAGATCATGGGAG CACTTGGGAAGTTGGGATTG 4 Cup69 SBI02 ACAGCACCAAGGTGAAGGAC ATGTAGGGCACCAGCTTCAC 5 Txp494 SBI03 CGTCCTCGTCTCCTTCGTC GCATGTTCAGGAGAGCATCA 6 Txp439 SBI03 CGAGGCGAGAGAGAGAGAGA AGTAGCAGCAGCGCCTGTAG 7 Sb1-10 SBI04 ACAGGGCTTTAGGGAAATCG CCATCACCGTCGGCATCT 8 Txp41 SBI04 TCTGGCCATGACTTATCAC AAATGGCGTAGACTCCCTTG 9 Txp23 SBI05 AATCAACAAGAGCGGGAAAG TTGAGATTCGCTCCACTCC 10 Txp123 SBI05 TCGGCGAGCATCTTACA TACGTAGGCGGTTGGATT 11 Txp6 SBI06 ATCGGATCCGTCAGATC TCTAGGGAGGTTGCCAT 12 Txp17 SBI06 CGGACCAACGACGATTATC ACTCGTCTCACTGCAATACTG 13 Txp481 SBI07 CCAGGAGATGCCAGAAGTGT GCATAAAACATTTGGAAACTCAAA 14 Txp159 SBI07 ACCCAAAGCCCAAATCAG GGGGGAGAAACGGTGAG 15 Txp321 SBI08 TAACCCAAGCCTGAGCATAAGA CCCATTCACACATGAGACGAG 16 Txp105 SBI08 TGGTATGGGACTGGACGG TGTTGACGAAGCAACTCCAAT 17 Txp289 SBI09 AAGTGGGGTGAAGAGATA CTGCCTTTCCGACTC 18 Txp010 SBI09 ATACTATCAAGAGGGGAGC AGTACTAGCCACACGTCAC 19 Txp20 SBI10 TCTCAAGGTTTGATGGTTGG ACCCATTATTGACCGTTGAG 20 Cup07 SBI10 CTAGAGGATTGCTGGAAGCG CTGCTCTGCTTGTCGTTGAG 表 A.2 20对扩展 核心引物 清单 序 号 标记 名称 染色 体 正 向 引 物（5-3）反向 引 物（5-3）1 Gap57 SBI01 ACAGGGCTTTAGGGAAATCG CCATCACCGTCGGCATCT 2 Txp80 SBI02 GCTGCACTGTCCTCCCACAA CAGCAGGCGATATGGATGAGC 3 Txp421 SBI03 AACTCCTAGGCAGTGAGCTTG TGCATCCGTCGTACTTGTTC 4 Txp424 SBI03 GCATCTGTAAGTTGCCACCA ACAGCTGCACTCCAGGATTT 5 Txp343 SBI04 CGATTGGACATAAGTGTC TATAAACATCAGCAGAGGTG 6 Txp60 SBI04 GCTAGCTGACGCACGTCTCTG TGCAACCGAGCGGTGACTA 7 Txp021 SBI04 GAGCTGCCATAGATTTGGTCG ACCTCGTCCCACCTTTGTTG 8 Txp65 SBI05 CACGTCGTCACCAACCAA GTTAAACGAAAGGGAAATGGC 9 Txp015 SBI05 CACAAACACTAGTGCCTTATC CATAGACACCTAGGCCATC DB22/T 1589 2012 10 表 A.2（续）序 号 标记 名称 染色 体 正 向 引 物（5-3）反向 引 物（5-3）10 SBKAFGK1 SBI05 AGCATCTTACAACAACCAAT CTAGTGCACTGAGTGATGAC 11 Txp317 SBI06 CCTCCTTTTCCTCCTCCTCCC TCAGAATCCTAGCCACCGTTG 12 Txp274 SBI06 GAAATTACAATGCTACCCCTAAAAGT ACTCTACTCCTTCCGTCCACAT 13 Txp99 SBI07 CACAAAGGCACCGAACAAAAC CAGAGGCCGAGGACGAG 14 Txp168 SBI07 AGTCAAAACCGCCACAT GAGAAGGGGAGAGGAGAA 15 Gpsb067 SBI08 TAGTCCATACACCTTTCA TCTCTCACACACATTCTTC 16 Txp516 SBI08 TCCGAGACAACAGGGAGAAG TCCCGCTACTGCATTTCTTT 17 Txp287 SBI09 GCAAGCGAGCTGACTTATGTAACGAGA CAAAGTGCTACTAAACCTATGCAGGGTGAA 18 Txp230 SBI09 GCTACCGCTGCTGCTCT AGGGGGCATCCAAGAAAT 19 Cup02 SBI09 CGAGAAGATCGAGAGAACCC TGAAGACGACGACGACAGAC 20 Cup43 SBI10 GCCTAACTCCCTTGTGATGC GTCAGTGGATGTGGATGTGC DB22/T 1589 2012 11 B B 附 录 B（资 料性 附录）引物 相关信息 表 B.1 20对基本 核心引物 相关信息 序 号 标记 名称 左 CM 右 CM 等 位 变异数 PIC 等 位 变异 片段大小（bp）参 照品种 231 TX430 225 吉 L116R 1 Txp482 25.2 25.2 3 0.598 221 晋梁 5号 172 白 平 168 7501B 2 Gpsb089 53.8 53.8 3 0.6649 163 晋梁 5号 223 晋梁 5号 3 Cup26 166.8 168.2 2 0.4965 218 7501B 247 晋梁 5号 4 Cup69 198.5 198.5 2 0.4671 235 7501B 221 314B 203/215 TX430 212 TX622B 209 晋梁 5号 203 F4B 197 7788 5 Txp494 4.2 4.2 7 0.6997 194 7501B 189 232EB 187 吉 R13 185 V4B 179 135B 176 吉 恢 7384 175 克恢 22号 6 Txp439 127.3 127.3 7 0.8135 172 甜 选 44 297/311 龙 杂 5 303 TX430 297 晋梁 5号 7 Sb1-10 87.6 87.6 5 0.5862 283 QL33B DB22/T 1589 2012 12 表 B.1（续）序 号 标记 名称 左 CM 右 CM 等 位 变异数 PIC 等 位 变异 片段大小（bp）参 照品种 295 7501B 283 白 平 277 F4B 272 R5933 8 Txp41 106.2 108 5 0.7046 264 辽恢 115 205 白 平 200 克恢 22号 194 铁恢 208 186 TX430 182 晋梁 5号 9 Txp23 75.9 75.9 6 0.8155 174 314B 272 TX622B 266 5-27 257 7501B 10 Txp123 93.1 93.1 4 0.5118 253 白 平 420 V4B 413 QL33B 399 铁恢 208 11 Txp6 31.6 31.6 4 0.714 381 三 尺 三 186 三 尺 三 182 白 平 166 铁恢 208 12 Txp17 149.3 149.3 4 0.6796 160 吉 恢 7384 223 F4B 217 5-27 213 晋福 1号 207 合 恢 8号 13 Txp481 31.8 31.8 5 0.6939 203 晋梁 5号 181 吉 恢 7384 177 7501B 171 V4B 163 晋梁 5号 14 Txp159 38.3 38.3 5 0.7552 152 314B DB22/T 1589 2012 13 表 B.1（续）序 号 标记 名称 左 CM 右 CM 等 位 变异数 PIC 等 位 变异 片段大小（bp）参 照品种 235 克恢 22号 229 晋梁 5号 223 绿 高粱 217 合 恢 8号 210 传 种高粱 205 314B 200 三 尺 三 196 吉 R13 15 Txp321 104.2 104.2 9 0.8159 186 黑 11B 290 TX622B 16 Txp105 97.7 97.7 2 0.3388 284 7501B 328 sg1681 319 甜 选 44 293 低 晋 5 287 TX622B 271 晋福 1号 17 Txp289 23.5 38.5 6 0.6671 268 7501B 147 晋福 1号 146 QL33B 144 F4B 142 TX430 140 314B 18 Txp010 108.4 108.4 6 0.7255 131 黑 11B 246 QL33B 242 7501B 238 白 平 219 F4B 204 晋梁 5号 19 Txp20 53.2 54.2 6 0.7568 189 克恢 22号 269 V4B 266 7501B 254 F4B 191/266 TX430 20 Cup07 115.2 115.2 5 0.5956 189 铁恢 208 DB22/T 1589 2012 14 表 B.2 20对扩展 核心引物 相关信息 序 号 标记 名称 左 CM 右 CM 等 位 变异数 PIC 等 位 变异 片段大小（bp）参 照品种 297/311 龙 杂 5 305 7501B 297 晋梁 5号 1 Gap57 108.9 109.7 4 0.5918 283 TX622B 305 吉 R13 298 白 平 2 Txp80 18 19.7 3 0.2995 280 晋福 1号 153/182 甜 选 44 170 7501B 168 Sg1681 3 Txp421 137.4 137.4 4 0.3707 153 V4B 239 白 平 236 吉 L116R 232 7501B 4 Txp424 147.8 149.9 4 0.6617 224 铁恢 208 157 黑 30B 153 7501B 150 铁恢 6号 125/147 辽 杂 12 131 135B 125 白 平 5 Txp343 71.4 75.8 8 0.6394 121 南 133R 225 7501B 6 Txp60 120.7 120.7 2 0.6402 221 晋梁 5号 188 2-27 184 7413-24 179 V4B 175 铁恢 208 173 黑 30B 7 Txp021 153 153 6 0.4872 169 晋梁 5号 133 黑 11B 131 吉 R13 128 5-27 123 TX622B 8 Txp65 14.4 14.4 5 0.4394 119 合 恢 8号 DB22/T 1589 2012 15 表 B.2（续）序 号 标记 名称 左 CM 右 CM 等 位 变异数 PIC 等 位 变异 片段大小（bp）参 照品种 228 黄壳黄米 高粱 219 白 平 212 QL33B 209 TX430 9 Txp015 58.2 58.2 5 0.6985 197 5-27 135 埃塞 45 128 5-27 123/129 TX430 121 232EB 10 SBKAFGK1 89.3 95.7 5 0.4727 117 晋梁 5号 165 洋 大 粒 162 吐鲁番密穗 高粱 158 0-30 155