I C S 1 1.2 2 0B 4 1备 案 号：DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 7 9 4 2 0 1 2禽 流 感 病 毒 免 疫 层 析 检 测 方 法M e t h o d o f t h e i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i c a s s a y f o r t h ed e t e c t i o n o f a v i a n i n f l u e n z a v i r u s2 0 1 2-0 1-0 6 发 布 2 0 1 2-0 3-0 1 实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 4 2/T 7 9 4 2 0 1 2I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 缩 略 词.13 实 验 原 理.14 实 验 条 件.15 实 验 材 料.16 样 品 处 理.27 实 验 方 法.28 结 果 判 定.29 注 意 事 项.3D B 4 2/T 7 9 4 2 0 1 2I I前 言本 标 准 按 G B/T 1.1-2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口。本 标 准 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院、武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司、湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心。本 标 准 起 草 人：金 梅 林、陈 焕 春、但 汉 并、郭 学 波、董 晓 辉、宋 念 华、张 安 定、周 红 波、孙 小 美、李 淑 云、周 艳 君、田 峰。D B 4 2/T 7 9 4 2 0 1 2I I I引 言禽 流 感 病 毒（A v i a n I n f l u e n z a V i r u s,A I V）具 有 易 变 异 的 特 点，可 通 过 突 变 获 得 对 人 的 感 染 力 和 致病 能 力，导 致 严 重 的 公 共 卫 生 危 害。为 加 强 禽 流 感 监 测，制 定 了 禽 流 感 病 毒 免 疫 层 析 检 测 方 法，本方 法 具 有 简 便、快 速 的 优 点，尤 其 适 合 基 层 现 场 使 用。D B 4 2/T 7 9 4 2 0 1 21禽 流 感 病 毒 免 疫 层 析 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 禽 流 感 病 毒 免 疫 层 析 检 测 的 方 法 的 缩 略 词、实 验 原 理、实 验 材 料、样 品 处 理、实 验 方法、结 果 判 定 和 注 意 事 项 等。本 标 准 适 用 于 禽 类 咽/鼻 拭 子、肛 拭 子、内 脏 组 织、鸡 胚 尿 囊 液 及 细 胞 培 养 物 中 禽 流 感 病 毒 的 检 测。2 缩 略 词下 列 缩 略 词 适 用 于 本 标 准。T 线：检 测 线C 线：质 控 线3 实 验 原 理本 方 法 用 抗 禽 流 感 病 毒 核 蛋 白 的 单 克 隆 抗 体 标 记 胶 体 金 颗 粒，以 硝 酸 纤 维 素（N C）膜 为 载 体，利用 微 孔 膜 的 毛 细 管 作 用，滴 加 在 膜 条 一 端 的 液 体 慢 慢 向 另 一 端 渗 透。在 移 动 过 程 中 免 疫 金 复 合 物 会 与N C 膜 表 面 检 测 线、质 控 线 处 包 被 的 抗 体 发 生 反 应，并 通 过 免 疫 金 的 颜 色 显 示 出 来。样 品 中 含 有 禽 流 感病 毒 时，在 检 测 线 和 质 控 线 位 置 均 出 现 红 色 的 条 带。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温（1 8 2 5）进 行。4.2 仪 器台 式 低 温 高 速 离 心 机、微 量 移 液 器、冰 箱、吸 头。4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护。5 实 验 材 料5.1 检 测 卡禽 流 感 病 毒 检 测 试 纸 条 装 在 塑 料 卡 中 制 成 检 测 卡，铝 箔 密 封，内 装 干 燥 剂，室 温 或 冷 藏 保 存。检 测卡 结 构 如 图 1 所 示。D B 4 2/T 7 9 4 2 0 1 22图 15.2 样 品 处 理 液取 2 4.2 g T r i s B a s e 和 1 0 m L T r i t o n-x 1 0 0，加 注 射 用 水 至 1 L,调 p H 值 至 9.0，过 滤 除 菌，无 菌 分 装，1 m L/管。6 样 品 处 理6.1 咽/鼻 拭 子、肛 拭 子将 收 集 的 咽/鼻 拭 子、肛 拭 子 插 入 到 含 有 处 理 液 的 样 品 管 中，充 分 混 合，使 其 溶 解，以 1 2,0 0 0 r/m i n离 心 1 0 m i n，取 上 清。6.2 内 脏 组 织称 取 组 织 块 0.5 g，置 于 匀 浆 器 中，加 生 理 盐 水 1 m L，研 磨 后 取 出 组 织 浸 出 液，然 后 置 2 8，1 2,0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n，取 上 清。6.3 鸡 胚 尿 囊 液鸡 胚 尿 囊 液 以 1 2,0 0 0 r/m i n 离 心 2 m i n，取 上 清。6.4 细 胞 培 养 物细 胞 培 养 物 可 直 接 用 于 检 测 或 者 冻 融 一 次 后 检 测。7 实 验 方 法将 检 测 卡 置 于 平 整 台 面 上，取 适 量 样 品 8 0 L 1 2 0 L（约 3 滴 4 滴），缓 慢 滴 加 到 样 品 孔 中，当 看 到 红 色 液 体 在 试 纸 条 上 移 动 时，放 慢 加 样 速 度。整 个 加 样 过 程 在 1 m i n 内 完 成。加 样 完 成 后 5 m i n 3 0 m i n 内 观 察 的 结 果 有 效。8 结 果 判 定D B 4 2/T 7 9 4 2 0 1 238.1 阳 性 结 果在 试 纸 条 上 出 现 两 条 红 色 的 条 带（T 线 和 C 线）。8.2 阴 性 结 果在 试 纸 条 上 仅 出 现 一 条 红 色 的 条 带（C 线）。8.3 无 效 结 果在 试 纸 条 质 控 线（C 线）处 不 出 现 红 色 的 条 带。9 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施，废 弃 物 收 集 后 进 行 无 害 化 处 理。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _