ICS 67.120.30 B 50 备案号：35809-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1676 2012 冻鲜鱿鱼多种致病菌的测定 多重 PCR法 Determination of food-borne bacterial pathogens from frozen squid Multiple PCR 2012-12-17发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1676 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4给出的规则起草。本标准由珲春出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珲春出入境检验检疫局综合实验室、吉林农业大学。本标准主要起草人：聂丹丹、王宁宁、陶希三、杨文光、席家文、谭立新、李晶、张琦、宋立甫、赵欣玥。DB22/T 1676 2012 1 冻鲜鱿鱼多种致病菌的测定 多重 PCR法 1 范围 本标准规定了冻鱿鱼中沙门氏菌 Salmonella、单核细胞增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes、副溶血性弧菌 Vibrio parahemolyticus及霍 乱 弧菌 Vibrio cholerae的 多重 PCR方法。本标准 适用于 冻鱿鱼中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌及霍 乱 弧菌的 测 定。2 规范性引用文件 下列 文 件对于 本文 件 的 应用是必不可少 的。凡是注日期 的 引用 文 件，仅注日期 的 版 本 适用于 本文 件。凡是不注日期 的 引用 文 件，其最 新 版 本（包括所有 的 修改 单）适用于 本文 件。GB 4789.4 食品安全 国家标准 食品微 生 物 学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.7 食品卫 生 微 生 物 学检验 副溶血性弧菌检验 GB/T 4789.20 食品卫 生 微 生 物 学检验 水产食品 检验 GB 4789.30 食品安全 国家标准 食品微 生 物 学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 6682 分析 实验室 用水 规 格 和 试 验 方法 GB 19489 实验室 生 物安全通用 要 求 SN/T 1022 进 出口 食品 中霍 乱 弧菌检验 方法 WS/T 230-2002 临床诊断 中 聚 合 酶链式反应（PCR）技术 的 应用 3 缩略语 下列缩略语适用于 本文 件。PCR：聚 合 酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)DNTP：脱氧 核 苷酸 三 磷酸（Deoxyribonucleoside Triphosphate）DATP：脱氧腺苷 三 磷酸（Deoxyadenosine Triphosphate）DCTP：脱氧 胞 苷 三 磷酸（Deoxycytidine Triphosphate）DGTP：脱氧鸟苷 三 磷酸（Deoxyguanosine Triphosphate）DTTP：脱氧胸苷 三 磷酸（Deoxythymidine Triphosphate）SDS：十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)Aminomethane）CTAB：十六烷基 三 乙基溴化铵（Hexadecyltrimethyl Ammonium Bromide）TE：Tris-HCl与 EDTA（pH 8.0）混 合 缓冲液 Taq 酶:Taq DNA 聚 合 酶 4 防污染措施 按照 WS/T 230-2002中 6的规定 执行。DB22/T 1676 2012 2 5 试剂和材料 除另 有 规定 外，所有化 学 试 剂均采 用分析 纯。5.1 标准菌株 为 了 保护 实验室人 员 的 安全，应 由 具备资 格 的 工作 人 员 检 测 沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍 乱 弧菌及 其 他致病 菌的 所有 培养 物 和 小心处置废 物，并按 GB 19489中的 有 关 规定 执行。阳 性菌 株：沙门氏菌 ATCC 12011；单核细胞增生李斯特氏菌 ATCC 19111；副溶血弧菌 ATCC 17802；霍 乱 弧菌 JL.08108。阴 性菌 株：（对 照 采 用 任意一种非目 标菌）李斯特菌 ATCC 19119；普 通 变形杆 菌 ATCC 33420；金黄 色葡萄球 菌 ATCC 12600；小肠耶尔森 菌 ATCC 23715；大 肠杆 菌 ATCC 11229；克雷伯 氏菌 ATCC 43086；粪肠球 菌 ATCC 14500；蜡样芽 胞 杆 菌 ATCC 11176。5.2 试剂 5.2.1 水：应 符 合 GB/T 6682中 一级 水 的规 格。5.2.2 DNA提 取 液：主要 成 分是 CTAB，Tris，EDTA。5.2.3 蛋白 酶 K。5.2.4 RNA酶。5.2.5 三 氯 甲烷（氯仿）CHCl3。5.2.6 异戊醇 C5H12O。5.2.7 无 水乙 醇 C2H5OH。5.2.8 TE缓冲液（见附录 A.1）。5.2.9 10 PCR缓冲液。5.2.10 Taq DNA 聚 合 酶。5.2.11 DNA分 子量 标 记 物（100 bp 1 000 bp）。5.2.12 PCR反应 管（1.5 mL、200 L）。5.2.13 常见致病 菌 普 通 PCR检 测试 剂盒。5.2.14 琼脂糖。5.2.15 10 上样 缓冲液（见附录 A.2）。5.2.16 50 TAE缓冲液（见附录 A.3）。6 仪器和设备 6.1 PCR仪。6.2 电泳装置。6.3 凝胶 分析 成像系统。6.4 生 物安全 柜。6.5 低温 冰箱（-80）、冷藏冷 冻 冰箱（2 8 和-20）。6.6 高压灭 菌 锅。6.7 恒 温 水 浴箱（室 温 100）。6.8 高速台 式 离 心 机(离 心 转速 12 000 r/min以 上)，台 式 离 心 机（离 心 转速 2 000 r/min）。6.9 微 量 可 调移 液 器（2 L、10 L、100 L、1 000 L）。DB22/T 1676 2012 3 7 检测程序 普 通 PCR方法 检 测 程序参 见附录 B。8 样品制备 样 品应 冷 冻 保 存，解 冻 后 应 尽快依 照 GB/T 4789.20的 相 关 规定，在 无 菌 条 件下对 鱿鱼 进行 局 部 取样，取样 25 g（mL）加 入 到含 有 225 mL无 菌 培养 液 中，在拍击 式 均 质器 上 连续 均 质 1 min 2 min。9 操作步骤 9.1 增菌培养和分离 9.1.1 沙门氏菌按照 GB 4789.4方法进行。9.1.2 单核细胞增生李斯特氏菌 可 按照 GB 4789.30方法进行。9.1.3 副溶血性弧菌按照 GB 4789.7方法进行。9.1.4 霍 乱 弧菌按照 SN/T 1022方法进行。9.2 细菌模板 DNA的提取 对于 上 述 方法 培养 的增菌 液，各 取 增菌 液 1 mL均 加到 一 个 1.5 mL无 菌 离 心管 中，8 000 r/min离 心 5 min，吸弃 上 清 液，加 入 500 L CTAB、40 L蛋白 酶 K，震荡 均 匀，65 温 浴 30 min；加 入 500 L三氯 甲烷：异戊醇（24：1），震荡，12 000 r/min 离 心 15 min；吸 取上 层 水 相至 1.5 mL离 心管 中，加入 等体积 的 异 丙 醇，震荡 均 匀，12 000 r/min离 心 10 min；弃 上 清 液，用 预热至 65 TE缓冲液 溶 解DNA（TE量 视 DNA沉淀 的 多少 而 定）；加 入 5 L RNA 酶 溶 液，37 温 浴 30 min；加 入 200 L三 氯 甲烷：异戊醇（24：1），震荡，12 000 r/min 离 心 15 min；吸 取上 层 水 相至 新的 1.5 mL 离 心管 中，加 入等体积 的 异 丙 醇，震荡 均 匀，12 000 r/min 离 心 10 min；弃 上 清 液，加 入 70%乙 醇 洗涤沉淀 DNA，12 000 r/min离 心 1 min；弃 上 清 液，干燥，加 50 L预热至 65 TE缓冲液 溶 解 DNA。（如 不 能 及 时 检验，可 将 上 清 液于-20 保 存）。也 可 使 用 细菌 基 因组 DNA提 取 试 剂盒 并按 其 说明 提 取 制 备 模板 DNA。如 不 能 及 时 检验，提 取 的 DNA可于-20 保 存。9.3 多重 PCR扩增 9.3.1 引物 沙门氏菌的主要 毒力因 子 invA作为 本 研究选 用 的 靶 基 因；绝 大 多 数 单核细胞增生李斯特氏菌 毒力 基因 的 转 录 表达受到 prfA蛋白 的 调控，因此 作为 单核细胞增生李斯特氏菌的 靶 基 因；副溶血性弧菌的 靶 基因选 用 的 是 具 有 种 属 特 异 性的 不 耐热 tlh；OmpW是 霍 乱 弧菌的主要 外 膜 蛋白 之 一，本 研究 采 用其 作为 靶 基 因。引物 的 序 列 参 见附录 C中 C.1。9.3.2 空白对照、阴性对照和阳性对照设置 空 白 对 照 设 为 以 水 代替 DNA模板；阴 性 对 照 采 用 任意一种非目 标菌(李斯特菌 ATCC 19119；普 通 变形杆 菌 ATCC 33420；金黄色葡萄球 菌 ATCC 12600；小肠耶尔森 菌 ATCC 23715；大 肠杆 菌 ATCC 11229；克雷伯 氏菌 ATCC 43086；粪肠球 菌 ATCC 14500；蜡样芽 胞 杆 菌 ATCC 11176)的 DNA作为 PCR反应 的 模板；DB22/T 1676 2012 4 阳 性 对 照 采 用 含 有 沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍 乱 弧菌的 DNA作为 PCR反应 的 模板。9.3.3 多重 PCR反应体 系 反应 体 系 和 扩 增 参数：模板 DNA 8 L(4 种 菌 各 2 L),上、下 游 引物 各 8 L(4 种 引物 各 2 L),dNTP 4 L(2.5 mmol/L),Taq酶 0.6 L(5 U/L)，10 Taq酶 buffer 5 L，MgCl2溶 液 5 L，其 余用 去 离 子 水 补足，总 体积 50 L(参 见附录 C中 C.2)。9.3.4 多重 PCR反应 条 件 94 预 变 性 5 min，94 变 性 45 s，58 退火 45 s，72 延伸 45 s，依 次 进行 30个 循环，循环 结束 后 72 延伸 10 min。结束 反应，4 保 存。9.3.5 多重 PCR扩增 产 物的 电泳 检测 用 电泳 缓冲液（1 TAE）制 备 2%琼脂糖凝胶（55 60 时加 入 溴化乙 锭 至 终浓度 为 0.5 g/mL）。取 8 L 15 L PCR扩 增 产物，分 别 和 2 L上样 缓冲液混 合，进行 点 样，用 100 bp laddermarker作 参照。选 用 恒压 3 V/cm 5 V/cm，电泳 30 min 60 min，电泳 检 测 结果 用 凝胶成像 分析 系统记录 并 保 存。10 结果判 定和 报告 在 阴 性 对 照 未 出 现 条 带，阳 性 对 照出 现 预 期 大 小 的 扩 增 条 带 条 件下，如 待 测 样 品 未 出 现 相 应 4条 带 中 任意一 条 大 小一致 的 扩 增 条 带，则 可 报告该 样 品 检验 结果 为阴 性；如 待 测 样 品 出 现 预 期 扩 增 条 带 则 可 判 定 该 样 品 结果 为 假 定 阳 性，则 应 按照 GB 4789.4、GB 4789.7、GB 4789.30和 SN/T 1022该 致病 菌 对应的标准检 测方法进行 确认，最 终结果 以后 者 的检 测 结果 为 准。如 果 阴 性 对 照出 现 条 带 和/（或）阳 性 对 照 未 出 现 预 期 大 小 的 扩 增 条 带，本 次待 测 样 品 的 结果 无 效，应重 新 做 实验，并 排 除 污染 因 素 11 废弃 物 处理 检验 过 程 中的 废 弃 物，收集 后 进行 高压 蒸汽 灭 菌 处 理或 其 他 等 效 的 处 理 方法。DB22/T 1676 2012 5 A A 附 录 A（规范性 附录）试剂 配 制 A.1 TE Tris-HCl EDTA（pH 8.0）按 10:1比例 混 合。A.2 10上 样 缓冲液 溴 酚蓝 0.25%二甲 苯青 FF 0.25%甘油 水 溶 液 30%A.3 50 TAE缓冲液 Tris 484 g 冰 醋 酸 114.2 mL EDTA（pH:8.0）200 mL(0.5 mol/L)溶 于水 中，定 容 至 2 L。DB22/T 1676 2012 6 B B 附 录 B（资 料性 附录）PCR方法检测程序 图 1 PCR检测 4种致病菌程序 图 DB22/T 1676 2012 7 C C 附 录 C（资 料性 附录）PCR检测的 靶基因、引物序 列 和反应 参数 C.1 PCR检测的 靶基因、引物序 列 表 C.1 PCR检测的 靶基因、引物序 列 致病 菌 靶 基 因 名称 引物 序 列 扩 增 片段长度 沙门氏菌 invA 5-gaccatttcaatgggaactct-3 5-atcgagatcgccaatcag-3 198bp1 单核细胞增生李斯特氏菌 prfA 5-gatacagaaacatcggttggc-3 5-gtgtaatcttgatgccatcag-3 274bp2 副溶血性弧菌 tlh 5-aaagcggattatgcagaagcactg-3 5-gctactttctagcattttctctgc-3 450bp2 霍 乱 弧菌 ompW 5-caccaagaaggtgactttattgtg-3 5-gaacttataaccacccgcg-3 588bp2 C.2 反应 参数 表 C.2 多重 PCR反应体 系 试剂 储备液浓度 50 L反应体系中加样体积/L 10 PCR缓冲液（无 镁 离 子）-5 氯 化 镁（MgCl2）25 mmol/L 5 dNTP 2.5 mmol/L 4 上 游 引物 2 4 下 游 引物 10 pmol/L 2 4 Taq酶 5 U/L 0.6 DNA模板-2 4 双蒸 水-补 至 50 注：反应 体 系 中 各 种 试 剂 的 量 可 根据 具 体 情况或 不 同 的 反应 总 体积 进行适 当 调 整。DB22/T 1676 2012 8 参 考 文 献 1 赵 明 光,万根平,黄 勇,邓秋莲，谢永强:四 种 儿童 常见肠 道 致病 菌的 多重 PCR检 测.广东医 学 2009,30(008):1069-1071.2 SN/T 1869-2007 食品 中 多 种致病 菌 快速 检验 方法 PCR法 _