ICS 65.020.30 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB37/T 4674 2023 猪塞尼卡 谷病毒的 检测 重 组酶恒温 扩增法 2023-11-14 发布 2023-12-14 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB37/T 4674 2023 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由山 东省 畜牧 兽医 局提出 并组 织实 施。本文件 由山 东省 畜牧 业标 准化技 术委 员会 归口。DB37/T 4674 2023 1 猪 塞尼卡 谷病毒的 检测 重组酶恒 温扩增 法 1 范围 本文件描述了猪塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus,SVV）的 重 组 酶 恒 温 核 酸 扩 增 检 测（Recombinase Polymerase Amplification）方法。本文件 适用 于猪 塞尼 卡谷 病毒的 快速 检测、诊 断、检疫、监测 和流 行病 学调 查。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室 生物 安全通 用要 求 NY/T 541 兽医 诊断 样品 采集、保存 与运 输技 术规 范 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 试剂或 材料 除非另 有规 定，仅使 用分 析纯试 剂。所用 液体 试剂 均需使 用无DNA/RNase 的 容 器进行 分装。RNA 提 取试 剂盒：市 售。4.1 重组酶 恒温 扩增 试剂 盒：市售。4.2 水：GB/T 6682，一 级。4.3 PBS 溶 液：pH 值7.4。4.4 称 取 磷 酸 二 氢 钾(KH2PO4)0.27 g、磷 酸 氢 二 钠(Na2HPO4)1.42 g、氯 化 钠(NaCl)8 g、氯 化 钾(KCl)0.2 g，加 灭菌 水约800 mL 充分搅 拌溶 解，加入 浓盐 酸调pH 值至7.4，定 容至1 000 mL。0.1%DEPC 水。4.5 1 000 mL 水 中加1 mL DEPC，放在1 000 mL 容量 瓶中 静 置4 h 后备 用。重组酶 恒温 扩增 检测 引物：按附 录 A 规定。4.6 阳性、阴性 对照。4.7 阳性对 照：带 有SVV 序列DNA 全 长的 质粒。阴性对 照：已 知SVV 阴性 样本 的DNA。5 仪器设 备 荧光定 量PCR 仪：配 有配 套反应 管（板）。支 持多 通道检 测。5.1 分析天 平：精度 为1 mg。5.2 DB37/T 4674 2023 2 高速冷 冻离 心机：转 速不 低于 13 000 g/min。5.3 冰箱：2 8 和-20 以下。5.4 酸度计。5.5 电热恒 温水 槽：室温 至 100。温度 精度 0.5。5.6 涡旋振 荡器。5.7 微量移 液器：10 L、20 L、100 L、1 000 L。5.8 离心管：1.5 mL。无DNase 和RNase。5.9 6 试验步 骤 样品 6.1 符合GB 19489 和NY/T 541 中关于 实验 室生 物安 全和 兽医诊 断样 品的 采集 和保 存的要 求。6.1.1 样品采 集 6.1.1.1 棉拭子 样品 无菌采 集猪 口鼻 棉拭 子。6.1.1.2 组织样 品 按照NY/T 541 兽 医诊 断样 品采集、在运 抵检 测地点 前的样 品保 存与 运输 技术 规范确 定的 规程，无 菌采集病 死猪 的淋 巴结、脾、胸腺、肠 粘膜 和肺 等组 织样品。6.1.2 样品的 保存 2 8 不超 过24 h，-20 以 下不 超过3个 月，-70 以 下不 超过10年。6.1.3 样品处 理 6.1.3.1 棉拭子 样品 处理 方法 口鼻拭 子管6 000 g/min震荡45 s，取200 L进行RNA 提取。6.1.3.2 淋巴结、脾、胸 腺等 组织 样品处 理 取0.05 g（0.01 g）组 织 块放入 盛有500 LPBS 缓 冲液的 研磨 管中，6 000 g/min 震 荡研 磨45 s，制成约10%的 组织 匀浆 液，5 000 g/min 离心5 min，取200 L 上清 液进 行RNA 提取。RNA 的 提取 6.2 按RNA 提取 试剂 盒说 明书 提 取样品 和对 照组 的RNA。提 取的RNA 应 立即 检测，否 则 应置于-70 冻 存。重组酶 恒温 核酸 扩增 6.3 6.3.1 扩增试 剂准 备 设50 L重组酶恒温核酸扩增反应 体系，扩增反应液体系见 表1。按重组 酶恒温扩增试 剂盒说明书配制体 系并 完成 相关 操作。DB37/T 4674 2023 3 表1 扩增反 应液 体系 组分 用量 L 1%DEPC 水 25.4 10 M SVV-F 2 10 M SVV-R 2 10 M SVV-Probe 0.6 模板 5 恒温扩增试剂 15 6.3.2 恒温扩 增反 应 选择检 测模式：FAM。将 加 样后的PCR 管 放入荧 光PCR 检测仪 内，做 好标 记。恒 温扩增 反应条 件按 照表2设 置。表2 恒温扩 增反 应条 件 反应 温度 39 循环 数 40 信号 采集 每30 s 反应 时间 20 min 结果判 定 6.4 6.4.1 阴性、阳性 结果 判定 结果判 定见 表3。表3 结果判 定 序号 通道 Ct 值 结果判断 1 FAM UNDET 或 40 样本低于检测限，报告为阴性 2 FAM 37 判定为阳性 3 FAM 3740 复检一次，如仍为 3740，则 判定为阴性 6.4.2 质控标 准 6.4.2.1 阴性对 照 无Ct 值或 大于37，并 且无 扩增 曲线。6.4.2.2 阳性对 照 的Ct 值应 小于 等 于 37，并 出现 典型 的扩 增 曲线。6.4.2.3 如阴性 和阳 性对 照不 满足 以上条 件，此次 实验 视为 无效。6.4.2.4 结果参 考图 谱见 附 录 B。DB37/T 4674 2023 4 A A 附录A（规范 性）重组酶 恒温 核酸 扩增 引物 重组酶 恒温 核酸 扩增 引物 见表A.1。表A.1 重组酶 恒温 核酸 扩增 引物 引物 序列 SVV-F 5-TTCTAAAGCGCAAATTCGTCCAAAACAACGACG-3 SVV-R 5-CCAGAATGTTGAGCCAACATAGAAACAGATTGC-3 SVV-Probe 5-TAAAGAATTTGGAAGCCATGCTCTCCTACTTC(FAM-T)(THF)(BHQ1-T)AGGAACACTACTCG-C3 spacer-3 DB37/T 4674 2023 5 B B 附录B（资料 性）结果判 定 阴性对 照和 阳性 对照 扩增 曲线见 图B.1。图B.1 阴性对 照和 阳性 对照 样本检 测曲 线见 图B.2。图B.2 样品检 测