ICS 67.050 X 04 备案号：37939-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1820 2013 粮食中串珠镰刀菌的 PCR检测 PCR detection of Fusarium moniliform in grains 2013-05-15发布 2013-09-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1820 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、魏春艳、刘金华、王莹、初真林、刘晓晖、周亮、王潇、张涛、王颖、冷喜芳。DB22/T 1820 2013 1 粮食中串珠镰刀菌的 PCR检测 1 范围 本标准规定了粮食中串珠镰刀菌的 PCR检测方法。本标准适用于粮食中串珠镰刀菌的快速筛选检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本适用于本文 件。凡是不注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB 4789.15 食品 微生物学 检验 霉 菌和 酵母计数 GB/T 4789.16 食品 卫生微生物学 检验 常见 产 毒霉 菌的 鉴 定 GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB 19489 实 验 室 生物安全通 用要 求 WS/T 230 临床诊断 中 聚合酶链式反 应（PCR）技术的应用 3 术语和定义 下列术 语 和定 义 适用于本标准。3.1 串珠镰刀菌 Fusarium moniliform 串珠镰刀菌 是一种重 要的 农作物病原 真菌，能引 起 禾 本 科作物 的 根腐、茎腐 和 穗腐，是玉米青枯病 和 穗腐病 的主要 病原 真菌 之一。3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR 模板 DNA先经高温变性成为 单 链，在 DNA聚合酶作 用和适 宜 的 反 应 条 件下，根据模板序 列 设计 的 两 条引物分 别与 模板 DNA两 条链 上相 应的 一 段互补 序 列 发 生 退火而相互结 合，接着 在 DNA聚合酶 的 作用下 以四 种 脱氧核糖核酸（dNTP)为 底 物，使退火 引物 得以延伸，然后 不断重 复 变性、退火 和 延伸这 一 循环，使 位于 两段已知 序 列 之 间 的 DNA片段呈几何倍 数 扩增。4 试剂和材料 除特别说明以外，所 用 试 剂 为分析 纯或 生 化 试 剂。4.1 水：应 符 合 GB/T 6682中 一 级 水 的规 格。DB22/T 1820 2013 2 4.2 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（Potato dextrose agar，PDA）：按 GB 4789.15规定。4.3 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB、1 400 mmol/L氯化钠、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris，用10%盐酸（HCl）调 pH至 8.0，121，20 min高 压灭 菌，储存 于 2 8。4.4 TE缓冲液：10 mmol/L Tris、150 mmol/L氯化钠、2 mmol/L EDTA、1%十二烷基磺酸钠，用 10%盐酸（HCl）调 pH至 8.0，121，20 min高 压灭 菌，储存 于 2 8 备 用。4.5 RNA 酶 溶液（5 g/L）。4.6 蛋白 酶 K（20 mg/mL)。4.7 Tris饱 和 酚。4.8 酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇（24：1）。4.9 异丙醇。4.10 70%乙醇。4.11 10 PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯化钾，15 mmol/L氯化 镁。4.12 引物 上游：5-CTTGGTCATGGGCCAGTCAAGAC-3 下游：5-CACAGTCACATAGCATTGCTAGCC-3 4.13 Taq DNA聚合酶。4.14 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。4.15 分 子 量标 记：2 000 bp DNA Marker。4.16 50 TAE电泳 缓冲液：称取 484 g Tris，量 取 114 mL冰醋 酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，溶 于 水 中，定 容 至 2 L。分 装 后 高 压灭 菌 备 用。使 用 前稀释 成 1 TAE电泳 缓冲液（工 作 液）。4.17 6 加样 缓冲液：30 mmol/L EDTA、36%（体积 分数）甘油、0.05%（质量 浓度）二甲 苯腈蓝 FF、0.05%(质量 浓度)溴 酚 蓝。4.18 琼脂糖：电泳 纯。4.19 阳 性 质 控 菌 株：来源 于 正 规菌 种 保藏机构 的串珠镰刀菌标准菌 株。4.20 阴 性 质 控 菌 株：来源 于 正 规菌 种 保藏机构 的 非目 标菌 株。5 仪器和设备 5.1 天平：感 量 0.001 g。5.2 生物安全 柜：AII型。5.3 霉 菌 培养 箱：28 1。5.4 高 压灭 菌 器。DB22/T 1820 2013 3 5.5 恒 温水 浴锅：65 1。5.6 高 速冷 冻离心机：转 速 不 低 于 12 000 r/min。5.7 PCR仪。5.8 核酸 电泳仪。5.9 凝胶 成 像 分析 系统。5.10 紫 外 分 光光度 计。5.11 涡旋混 合 器。5.12 微 量 移 液 器：0.2 L 2 L、2 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L。5.13 离心管：1.5 mL。6 生物安全措施 为 了 保护 实 验 室 人 员 的 安全，应由 具 备 资 格 的 工 作 人 员 检测真菌，所有 培养 物 应 小心处置。应按照GB 19489的规定 执行。7 废弃物处理和防止污染的措施 7.1 检验 过程 中的 废弃 物 需 经 121 高 压灭 菌 处理 至 少 30 min后 再弃置。7.2 检验 过程 中 防止交叉污染 的 措施 按 WS/T 230执行。8 检测 8.1 样品制备与培养 参 照 GB 4789.15对 样 品 进行稀释 与培养。8.2 串珠镰刀菌的初步鉴定 参 照 GB/T 4789.16进行。9 DNA提取 9.1 DNA模板制备 从 培养 平皿 上 刮 取 菌 丝 0.2 g 0.5 g于 1.5mL 离心管，加 入 少 许石英砂 用 细玻璃棒充 分 碾碎 菌 丝，加 入 500 L CTAB、40 L蛋白 酶 K，震荡均匀，65 水 浴 30 min；加 入 500 L酚：三氯甲烷：异戊 醇(25：24 1)，强烈震荡，12 000 r/min 离心 15 min；吸 取 上 层 水 相至 1.5 mL离心管 中，加 入 等 体 积 的 异丙醇，震荡 混 匀，1 2000 r/min离心 10 min；弃 上 清 液，用 预热 至 65 TE缓冲液溶 解 DNA（TE量 视 DNA沉淀 的 多 少 而 定）；加 入 5 LRNA 酶 溶液，37 水 浴 30 min；加 入 200 L三氯甲烷：异 戊醇(24 1)，强烈震荡，12 000 r/min 离心 15 min；吸 取 上 层 水 相至 新 的 1.5 mL 离心管 中，加 入 等 体DB22/T 1820 2013 4 积 的 异丙醇，震荡均匀，1 2000 r/min 离心 10 min；弃 上 清 液，加 入 1mL70%冰 乙醇 洗涤沉淀 DNA，12 000 r/min 离心 1 min；弃 上 清 液，无 菌 条 件下 自 然 干燥，加 预热 至 65 TE缓冲液溶 解 DNA。（如不能 及时 检验，可 将 提 取 液 于-20 保 存）。也 可 使 用 等效 的真菌 基 因组 DNA提 取 试 剂 盒。9.2 DNA浓度测定 采 用 紫 外 分 光光度 法测定 DNA，所 测 得 OD值 为 核酸 总 量。紫 外 分 光光度 法检测 核酸 浓度 的 最 佳范围 是 2 g/mL50 g/mL，值 应 该 在 0.051的 区 间 内。将 DNA溶液 做 适 当 的 稀释，放 入 紫 外 分 光光度 计 的 比色 皿 中，于 260 nm处 测定 其 吸收值，1 OD260nm=50 g/mL双 链 DNA或 38 g/mL单 链 DNA。PCR级 DNA溶液 的 OD260nm/OD280nm比值 为 1.72.0。9.3 PCR 检测 9.3.1 空白对照、阴性对照和 阳 性对照试 验 检验 过程 中 分 别 设 空 白 对照、阴 性 对照、阳 性 对照。空 白 对照 设为 以 水 代替 DNA模板；阴 性 对照采 用 非目 标菌的 DNA作为 PCR反 应的 模板；阳 性 对照 采 用串珠镰刀菌 DNA作为 PCR反 应的 模板。9.3.2 PCR反应 体系 表 1 PCR反应体系 试 剂 加 入量（L）10 PCR buffer 2.5 dNTP溶液(10 mmol/L)0.5 Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.2 上 游 引物(10 mol/L)1.0 下 游 引物(10 mol/L)1.0 DNA模板（100 ng/L)2.0 补 水 至 25 9.3.3 PCR扩增条 件 94 预 变性 3 min，94 变性 45 s，60 退火 1 min，72 延伸 1 min，共 35个 循环，最 后 72 延伸 5 min。不 同 仪器、不 同 Taq DNA聚合酶可根据 要 求 将 反 应 条 件 做 适 当 调 整。9.3.4 凝胶电泳 检测 PCR产 物 用 电泳 缓冲液（1 TAE）制 备 1.0%1.2%琼脂糖 凝胶（55 60 时 加 入 溴 化乙 锭 至 终 浓度 为 0.5 g/mL，也 可在 电泳 后 进行染 色）。取 8 L15 L PCR扩增 产 物，分 别 和 2 L上 样 缓冲液 混 合，进行 点 样，用 2 000 bp DNA Marker作 参 照。9 V/cm恒 压 电泳，电泳 40 min60 min，电泳 检测 结 果 用 凝胶 成 像 分析 系统记 录 并 保 存。10 结果描述 与 判 定 DB22/T 1820 2013 5 在 阴 性 对照 未 出 现 条 带，阳 性 对照出 现预 期 1.6 kb的 扩增 条 带 条 件下，如 测 试 样 品 未 出 现 1.6 kb的扩增 条 带，表示 样 品中 无 串珠镰刀菌 核酸；如 测 试 样 品出 现 1.6 kb扩增 条 带 则 表 明 样 品中 存 在 串珠镰刀 菌 核酸。_