ICS 01.040.65 CCS B 00/09 34 安徽省地方标准 DB34/T 4597 2023 冬小麦品 种抗倒春 寒性评价 规程 Regulations for evaluating the resistance of winter wheat varieties to late spring coldness 2023-10-07 发布 2023-11-07 实施 安徽省市 场监督 管 理局 发 布 DB34/T 4597 2023 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由安 徽农 业大 学提 出。本文件 由安 徽省 农业 农村 厅 归口。本文件 起草 单位：安 徽农 业大学、蒙 城县 种植 业发 展中心、阜 南广 平种 植专 业合作 社、安徽 永 民 种业有限 责任 公司、濉 溪县 农业技 术推广 中 心、淮北 三丰肥 业有 限公 司、淮北 双收种 业有 限责 任公 司。本文件主要起草人：陈翔、李金才、李 志 敏、李 明、周 楠、孙 建 强、吴 金 灵、李 佳 佳、刘 莉、圣 化 军、孙 晓伟、汪善洋、贾训强、赵伟。DB34/T 4597 2023 1 冬 小麦品 种抗倒春 寒性评 价规程 1 范围 本文件 规定 了冬 小麦 品种 抗倒春 寒性 评价 的鉴 定方 法、倒 春寒 处理 方法、主 要 指标选 择和 抗倒 春 寒性鉴定 评价 分级 等技 术内 容。本文件 适用 于冬 小麦 品种 抗倒春 寒性 的鉴 定 评 价。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 4404.1 粮 食作 物种 子 第1部 分：禾谷 类 GB/T 8321（所 有部 分）农药合 理使 用准 则 NY/T 496 肥料 合理 使用 准则 通则 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 鉴定 材 料与 方法 种子质 量 4.1 供试 小 麦种 质资 源和 品种 的种子 质 量 应符 合 GB 4404.1 的 规定。田间管理 4.2 4.2.1 供试材 料应 在 10 月 中下 旬播种。选 择直 径 30 cm，高 35 cm 的 圆柱 形盆，装 耕层 表土 并施 足基肥，埋于 试验 田中，盆 内土壤 与盆 外大 田齐 平。每个参 试材 料种 植 10 盆，每盆 定苗 9 株。4.2.2 在进行 小麦品 种抗 倒春寒 性评价 期间，要及 时防 治 病、虫、草和 鸟害，防止 倒伏等 不利情 况 发生。防 治 病 虫草 害 农 药使 用应符 合 GB/T 8321（所 有部分）和 NY/T 496 的 要求。倒春寒 处理 方法 4.3 4.3.1 人工模 拟倒 春寒 处理 冬小麦 生长 至 幼 穗分 化的 药隔形成 期（主 茎倒 二叶 伸出、第三 节间 伸长）时，将 盆栽 移入 人工 气 候培养室，相对 湿度 70%，光照夜 0 Lx，常 温对 照10（CK），分 别设 置-4、-2、0、2、4五个低温 处理，处 理时 间为 凌晨 1:00-5:00。倒 春寒 处理过 后移 回大 田原 位置 继续生 长。4.3.2 取样 DB34/T 4597 2023 2 倒春寒 处理 后 采 集胁 迫组 与对照 组小 麦主 茎倒 二叶 用于指 标测 定与 分析。5 抗倒春 寒性 指标 检测 可溶性 糖含 量 5.1 利用蒽 酮比 色法 检测 分析（参见 附录A）。保护酶 活性 5.2 5.2.1 超氧化 物歧 化酶（SOD）活性 利用氯 化硝 基四 氮唑 蓝光 化还原 法检 测分 析（参见 附录B）。5.2.2 过氧化 物酶（POD）活性 利用邻 甲氧 基苯 酚（愈创 木酚）显色 法检 测分 析（参见附 录C）。5.2.3 过氧化 氢酶（CAT）活性 利用紫 外吸 收法 检测 分析（参见 附录D）。丙二醛（MDA）含量 5.3 利用硫 代巴 比妥 酸法 检测 分析（参见 附录E）。可孕小 花数 5.4 小麦开 花期，取 主茎 穗观 察记录 可孕 小花 数（具有 雄蕊、子房、柱 头和 柱头 羽毛的 小花）。产量性 状 5.5 小 麦 收 获 期 间，每 种 材 料（处理和 对照）考察 10 个 单株主茎 的 穗下 节间 长度（cm）、小穗 结实 率、穗粒数（粒）、千粒重（g）等 产量 组分 及 性 状。6 抗倒春 寒性 鉴定 评价 分级 以可溶性糖含量、保护酶 活性、可孕小花数 和产量 组分等指标，进 行 主 成 分 分 析，同时运用隶 属函 6.1 数值对 各主 成分 得分 值进 行标准 化，获得一个小麦品种响应倒春寒胁迫综合值（D），根 据 D 值进 行 聚 类 分析。小 麦响 应倒 春寒 胁迫 综合值（D）按 照公 式（1）进行 计算：n i W X U Dii i，.3 2 1n1(1)min max min/X-X X X X U i i(2)nii i i P P W1/(3)式中：D 小麦 响应 倒春 寒胁 迫 综合值；DB34/T 4597 2023 3 U(Xi)通过 隶属 函数 方法分 析在 主成 分分 析中 的标准 数据；Xmax 每 个主 成分 中的 最大值；Xmin 每 个主 成分 中的 最小值；i 样本 数量；Wi 每个 主成 分中 的权 重系数；Pi 主成 分分 析中 每个 主成分 的特 征值。基于D 综合 值和 聚类 分析 图的平 均隶 属值 结果，冬 小麦抗 倒春 寒性 等级 按照 表1 进 行评 价。6.2 表1 冬小麦 抗倒 春寒 性等 级 D 值 抗倒春寒性等级 D 0.20 弱 0.20 D 0.35 较弱 0.35 D 0.50 中等 0.50 D 0.65 较强 D 0.65 强 DB34/T 4597 2023 4 附录A（资料 性）可溶性 糖含 量 将处理 组和 对照 组叶 片 在 110 烘箱 烘 15 min，然 后调至 75 烘 干至 恒重。干 叶片 磨粉 后称 取50 mg 样品 导入 10 mL 刻 度离心 管，管 内加 入 4 mL 80%的 乙醇，置于 80 水浴中 不断 搅拌 40 min，离心，收集 上清 液，其残 渣加入 2 mL 80%乙 醇重 复 提 2 次，合并 上清 液。在 上清液 中加 10 mg 活性炭，80 脱色 30 min，80%乙醇 定容 至 10 mL，过 滤后取 滤液 1 mL，加入 5 mL 蒽 酮试剂 混合，在沸水中 煮沸 10 min，取 出 后用水 冷却至 室温，使用 紫外可 见分光 光度 计在 625 nm 处 比色，计算 可溶性糖含 量。按公式（A.1）计算 可溶 性 糖含量：S=（C VT）（W Vt 103）(A.1)式中：S 可溶 性糖 含量（mg/g）；VT 提取 液体 积（mL）；Vt 吸取 样品 液体 积（mL）；W 样品 质量（g）。DB34/T 4597 2023 5 附录B（资料 性）超氧化 物歧 化酶（SOD）活性 按每克（叶 片鲜 重FW）小 麦新鲜 叶片 加入 3 mL 0.05 mol/L pH 7.8 磷 酸钠 缓 冲液，加入 少量 石英砂，于 冰浴 中的 研钵 内研 磨成匀 浆，定容 至 5 mL 刻度离 心管 中，于 8500 r/min（10000 g）冷冻 离心30 min，上 清液 即为SOD 酶 粗提液。每个处 理取 8 个 洗净干 燥好 的微 烧杯 并编 号，按计 算好的 量加 入各试剂及 酶液，反应 系统 总 体积为 3 mL。其中 4 号 8号 杯中磷 酸钠 缓冲液 量和酶 液量可 根据 试验 材料中酶 液浓度 及酶 活力进 行调整（如酶 液浓 度大、活性强 时，酶 用量 适当减 少）。各试剂 全部 加入 后，充分混 匀，取1 号微 烧杯置 于暗处，作 为空 白对 照，比 色时调 零用。其 余 7 个微 烧杯均 放在 温度 为 25。光强为 4500 Lux 的 光照 箱内（安装 有 3 根 20 W 的日光 灯管）照 光 15 min。然后 立即 遮光 终止 反 应。在 560 nm 波长下 以 1 号 杯液调 零，测 定各 杯液光 密度并 记录结 果。以 2、3 号杯液 光密 度的平 均值作为抑 制NBT 光还原 率 100%，根据 其他 各杯液 的光 密 度分别 计算出 不同 酶液量 在各反 应系统 中抑 制NBT光还原 的相对 百分 率。以 酶液用 量为横 坐标，以抑 制NBT光 还原 相对百 分率 为 纵坐标，作出 二者 相关 曲线。按公式（B.1）计算 超氧 化 物歧化 酶活 性：t W B V h FW g U A 60 1000/(B.1)式中：A 酶活 力（酶活 力单 位：U/（g（FW）/h）；V 酶提 取液 总体 积（mL）；B 一个 酶活 力单 位 的 酶 液量（L）；W 样品 鲜重（g）；t 反应 时间（min）；1000 换 算系 数，即1 ml=1000 L；60 换算 系数，即1 h=60 min。DB34/T 4597 2023 6 附录C（资料 性）过氧化 物酶（POD）活性 取处理 组与 对照 组小 麦植 株叶片1g（叶片 鲜重FW），剪碎 置于 研钵 中，加 5 mL 0.1 ml/L Tris-HCl缓冲液（pH8.5），研磨 成 匀浆，以 4000 r/min 离心 5 min，倒 出上 清液，必要时 残渣再 用 5 mL 缓冲液提 取一 次，合并 两次 上清液 备用。取 光径 1 cm 比色杯 2 个，向其 中之 一 加入上 述酶 液 1 mL（如酶活性 过高可 稀释），再 加入反 应混合 液 3 mL，立 即开启 秒表记 录时 间，于 分光光 度计 470 nm 波长下测量 吸光 值，每 隔 1 min 读数 一次，共测 3 min。向 另一比 色杯 中加 人 0.2 mol/L 磷 酸缓 冲液（pH6.0）作为零 对照。按公式（C.1）计算 过氧 化 物酶活 性：FW t V V A g U P T nm 1 470 01.0 min/(C.1)式中：P 过氧 化物 酶（POD）活性（U/（g min）；A470nm 反应 时间 内吸 光 度的变 化；VT 粗酶 提取 液总 体积（mL）；V1 测定 用粗 酶液 体积（mL）；FW 样品 鲜重（g）；0.01A470nm 每 下降0.01 为1个 酶活 单位（U）；t 反应 时间（min）。DB34/T 4597 2023 7 附录D（资料 性）过氧化 氢酶（CAT）活性 采集处 理组 与对 照组 植株 叶片 1.0 g（叶 片鲜 重FW）加入 pH 7.8 的 磷酸 缓冲 液少量，研 磨成 匀浆，转移至 10 mL 刻度 试管 中，用该 缓冲液 冲洗 研钵，并将冲 洗液转 入 刻 度试管 中，用 同一缓 冲液 定容，4000 r/min，离心 15 min，上清 液即 为过 氧化 氢酶 的粗酶 液。分别 取 3 支 10 mL 试 管，其中 2 支为样品测 定管（S1，S2），1 支为空 白管（S0）（将酶 液煮死），按顺 序分 别加 入 0.2 mL 粗酶 液、pH 7.8 磷酸缓 冲液 1.5 mL 和蒸 馏水 1.0 mL，25 预热 后，逐 管加 入 0.3 mL 0.1 mol/L 的H2O2，每加 完 1管立即 计时，并迅 速倒 入 石英比 色杯 中，240 nm 下 测定吸 光度，每隔 1 min 读数 1 次，共测 4 min，待 3 支管 全部 测定 完，计 算酶活 性。按公式（D.1）计算 过氧 化 氢酶活 性：FW t V V A g U C T nm 1 240 1.0 min/(D.1)其中：2 2 1 0 240 S S S nm A A A A 式中：C 过氧 化氢 酶（CAT）活性（U/（g min）；As0 加 入煮 死酶 液的 对 照管吸 光度；As1、As2 样 品管 吸光 度；VT 粗酶 提取 液总 体积（mL）；V1 测定 用粗 酶液 体积（mL）；FW 样品 鲜重（g）；0.1A240nm 每下 降0.1 为1 个酶活 单位（U）；t 加过 氧化 氢到 最后 一 次的读 数时 间（min）。DB34/T 4597 2023 8 附录E（资料 性）丙二醛（MDA）含量 采集处 理组与 对照 组植株 叶片 1.0 g（叶片 鲜重FW）将其 剪碎，加入 100 g/L 三氯 乙酸 2 mL 和少量的 石英 砂，研磨；进 一步加 入 8 mL TCA 充分 研 磨，匀 浆液 以 4000 r/min 离心 10 min，上清 液即为样品 提取 液。吸 取 2 mL 提取液，加入 2 mL 6 g/L 硫代巴 比妥 酸溶 液，混 匀后 于沸水 浴上 反应 15 min，迅速冷 却后 再离 心。取上 清液测 定 450 nm、532 nm 和 600 nm 波 长下 的吸 光 度。对 照以 2 mL 蒸 馏水代替提 取液。按公式（E.1）计算 丙二 醛 含量：M=6.45(A532-A600)0.56A450 VTW.(E.1)式中：M 丙二 醛糖 含量（umoL/g）;A450450 nm 波长 下的 吸光度；A532532 nm 波长 下的 吸光度；A600600 nm 波长 下的 吸光度；VT 提取 液体 积（L）；W 样品 质量（g）；