ICS 65.020.30 B 40 备案号：35741-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1607 2012 化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测 Detection of listeria monocytogenes in cosmetics 2012-12-01发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1607 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：孟日增、王宁、丁旭、刘韬、宋战均、刘金华、蔡阳、罗雁非。DB22/T 1607 2012 1 化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测 1 范围 本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法。本标准适用于化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新 版本（包括 所 有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB 7918.1 化妆品 微 生 物 标准检验方法 总 则 3 试剂和材料 3.1 水：为符合 GB/T 6682的 灭 菌 二级水。3.2 Half-Fraser培养基：见附录 A.1。3.3 Fraser肉汤：见附录 A.2。3.4 牛津琼脂（Oxford琼脂）：见附录 A.3。3.5 ALOA琼脂：见附录 A.4。3.6 胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)：见附录 A.5。3.7 胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)：见附录 A.6。3.8 绵羊血琼脂：见附录 A.7。3.9 糖类利 用 肉汤（鼠 李 糖 和 木糖）：见附录 A.8。3.10 CAMP（Christle，Atkins，Munch-Petersen）培养基及试 验菌 株：见附录 A.9。3.11 过氧 化 氢溶液：见附录 A.10。3.12 磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录 A.11。4 仪器和设备 4.1 恒温培养箱：25 1，30 1，35 1。4.2 恒温水浴锅：46 1。DB22/T 1607 2012 2 4.3 均 质器或灭 菌 乳钵。4.4 显微镜：10X 100X。4.5 接种环、接种针。4.6 灭 菌 试管：18 mm 180 mm。4.7 灭 菌 吸管：10 mL（具有 0.1 mL刻度）和 1 mL（具有 0.1 mL刻度）。4.8 灭 菌 量筒：容量 100 mL和 250 mL。4.9 灭 菌 培养皿：直 径 90 mm 100 mm。5 检验程序 单核细胞增生李斯特氏菌检测 程序 见 图 1。检 样（10 mL）初次 增菌 培养基（Half-Fraser 90 mL）30 1 培养 24 h 2 h 二 次 增菌 培养基（Fraser 10 mL）选择性 分 离 培养基（牛津、ALOA）35 1 培养 48 h 2 h 35 1 培养 48 h 2 h 选择性 分 离 培养基（牛津、ALOA）接种木糖、鼠 李 糖 35 1 培养 24 h 2 h 35 1 培养 48 h 2 h 木糖-，鼠 李 糖+接种木糖、鼠 李 糖 35 1 培养 24 h 2 h 纯 化、鉴 定 木糖-，鼠 李 糖+纯 化、鉴 定 图 1 单核细胞增生李斯特氏菌检测程序 DB22/T 1607 2012 3 6 操作步骤 6.1 样品稀释液制备 按照 GB 7918.1中的规定 执行。6.2 增菌培养 初次 增菌，取 1:10样 品 稀释 液 10 mL加到 90 ml Half-Fraser液 体 培养基 中，置 30 1 培养 24 h 2 h。二 次 增菌，取 0.1 mL初次 增菌的 培养物，加 入 到 10 mL Fraser培养液 中，置 35 1 培养 48 h 2 h。6.3 分离培养 用 接种环 取 培养过 的 Half-Fraser增菌 液 的 表层 培养物 划线 接种 于 牛津琼脂 和 ALOA琼脂 两 种 选择性平板上。将 二 次 增菌 培养物 按 同样步骤，划线 接种 于 牛津琼脂 和 ALOA琼脂 选择性平板上。置 35 1 培养 48 h 2 h。经 48 h恒温培养 后，检 查平板上 有 无 可 疑 单核细胞增生李斯特氏菌菌 落。培养 24 h的 典型 李斯特氏菌 在 牛津琼脂 上 为 细 小（1 mm）的 灰色 菌 落，其 外围 有 黑色晕圈，48 h后 菌 落变暗，可 见 绿色光泽，直 径约 2 mm，有 黑色 的 晕圈 并 且 中 间凹陷。典型 单核细胞增生李斯特氏菌 在 ALOA琼脂 上 为 蓝绿色 菌 落，颜色较 为 鲜艳，菌 落 直 径 1 mm，菌 落较小，圆形 规则，边缘整齐，有 较 为 明 显 不透明晕圈。6.4 糖发酵反应 从每 种 选择性 培养基 的 每一平板 中 选择 5个以上疑似 单核细胞增生李斯特氏菌的菌 落。如果一只平 板 中少于 5个疑似 菌 落，须确挑去 所 有 菌 落，分 别 接种 在 木糖 和 鼠 李 糖 发 酵管 中 35 1 培养 24 h 2 h；同时在 TSA-YE上划线纯 化，置 30 1 培养 24 h 48 h。选择 木糖 阴性、鼠 李 糖 阳 性 的 纯 培养物 继续进行鉴 定。6.5 鉴定 6.5.1 纯培养 6.4中 纯 化 培养 的 TSA-YE平板。6.5.2 过氧化氢酶试验 在 TSA-YE琼脂 平板 中 取 单 个 菌 落，悬浮 于 玻片 上一 滴 过氧 化 氢溶液 中 产气泡者 为 阳 性 反 应。6.5.3 革兰氏染色 从 TSA-YE琼脂 平板 中 取 单 个 菌 落进行 革兰 氏 染 色，单核细胞增生李斯特氏菌 为 革兰 氏阳 性，狭 长短棒状；用生 理 盐水 制成 菌 悬 液，在 油 镜或 相差 显微镜 下 观察，该 菌 呈现轻 微 旋转 或 翻滚 样 运动。6.5.4 协同溶血试验（CAMP）在 绵羊血 平板上 相 对 平行 接种 金 黄 色 葡萄球 菌和 马红球 菌 培养物（R.equi），接种 线 必 须 窄而 均 匀，可 通 过 用 接种环 和金 属 线 与 琼脂 平 面呈 直 角 的方 向（垂 直）接种 而得。在 它们 两个 培养物 中 间 靠近 1 mm2 mm处垂 直接种 可 疑 的单核细胞增生李斯特氏菌，但 不 能与 二 者 接 触。几 个 试 验菌 株 应 该 同时 接 种 于 同一平板 内。同样，垂 直接种 对照菌 株（单核增生李斯特氏菌、西尔 李斯特氏菌、英诺克 李斯特氏 菌）。如果 使 用 血琼脂，则 需 35 1 或 37 1 培养 18 h-24 h。待 验菌 株 与 金 黄 色 葡萄球 菌和DB22/T 1607 2012 4 马红球 菌 间-溶血 作 用增 强者 均可 认 为 是阳 性 反 应。单核细胞增生李斯特氏菌 或 西尔 李斯特氏菌 在 靠 近 金 黄 色 葡萄球 菌 接种 点 附 近 的 溶血 增 强，绵羊 李斯特氏菌 在 靠近马红 菌 接种 点 附 近 的 溶血 增 强，可 见明 显 的 箭头状 溶血 现象，其 他 单核细胞增生李斯特氏菌不 产 生 溶血 现象。6.5.5 生化鉴定 将上 述 可 疑 菌 做 进一步 的生化 实 验，单核细胞增生李斯特氏菌 与 其 它 李斯特氏菌的 区 别 见 表 1。如 果选择 生化 鉴 定 试 剂盒 或 全自动 微 生 物 生化 鉴 定 系统，可 根据 6.4.1的 初步 判断结 果，从 营 养琼脂 平板 上挑取 可 疑 菌 落，用生 理 盐水 制备成 浊 度 适 当 的菌 悬 液，使 用生化 鉴 定 试 剂盒 或 全自动 微 生 物 生化 鉴 定 系统 进行鉴 定。表 1 单核细胞增生李斯特氏菌菌 种 鉴定 的 反应特 征 产 酸 CAMP试 验 种类 溶血 性 鼠 李 糖 木糖 金 黄 色 葡萄球 菌 马红球 菌 单核细胞增生李斯特氏菌L.monocytohenes+-+-英诺克 李斯特氏菌 L.innocua-V-绵羊 李斯特氏菌 L.iuanuii+-+-+西尔 李斯特氏菌 L.seeligeri（-）-+（+）-威 尔 斯李斯特氏菌 L.welshimeri-V+-格 氏李斯特氏菌 L.grayi-墨 氏李斯特氏菌 L.murrayi-V-注：V为 反 应不定，（+）为 弱 性 反 应，+为 90%阳 性 反 应，-为 无 反 应。7 检验 结果报告 综 合 6.5中的 结 果，报告 10 g（mL）样 品中检出 或 未 检出单核细胞增生李斯特氏菌。DB22/T 1607 2012 5 A A 附 录 A（规范性 附录）培养 基 A.1 Half-Fraser肉汤 A.1.1 基本成份 A.1.1.1 成份 酪胨 5.0 g 胰 蛋白 胨 5.0 g 牛肉浸膏 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 氯 化 钠 20.0 g 磷酸氢二 钠 12.0 g 磷酸二氢 钠 1.35 g 七叶苷 1.0 g 水 1000 mL A.1.1.2 制备 将以上 组份 加 热 溶 解，调节 pH值至 7.2 7.4，分 装，121 高压 灭 菌 15min。A.1.2 氯 化 锂 溶液 A.1.2.1 成份 氯 化 锂 3.0 g 水 10 mL A.1.2.2 制备 将 氯 化 锂 加 入 水 中，过 滤除 菌。注 意：溶 解氯 化 锂 时一 定要 做 好预防措施，因 为 该反 应 大量 热 且 对 粘膜 有 刺激 作 用。A.1.3 萘啶酸钠 溶液 A.1.3.1 成份 萘啶 酸 钠 0.1 g 0.05 ml/L NaOH 溶液 10 mL A.1.3.2 制备 将 萘啶 酸 钠 溶 解 NaOH溶液 中，过 滤除 菌。A.1.4 盐酸吖碇黄素 溶液 DB22/T 1607 2012 6 A.1.4.1 成份 盐酸 吖碇 黄 素 0.25 g 水 100 mL A.1.4.2 制备 将 盐酸 吖碇 黄 素 溶 于 水 中，过 滤除 菌。A.1.5 柠檬酸铁（）铵 A.1.5.1 成份 柠檬 酸 铁（）铵 5.0 g 水 100 mL A.1.5.2 成份 将 柠檬 酸 铁（）铵 溶 于 水 中，过 滤除 菌。A.1.6 全 培养 基 A.1.6.1 成份 基 本 成 份（A.1.1）100 mL 氯 化 锂 溶液（A.1.2）1.0 mL 萘啶 酸 钠 溶液（A.1.3）0.1 mL 吖啶 黄 盐酸盐（A.1.4）0.5 mL 柠檬 酸 铁（）铵 溶液（A.1.5）1.0 mL A.1.6.2 制备 使 用 前，将上 述 四 种溶液分 别加 入 到 100 ml的 基 本 成 份 中 去。A.2 Fraser肉汤 A.2.1 基本成份 A.2.1.1 成份 酪胨 5.0 g 胰 蛋白 胨 5.0 g 牛肉浸膏 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 氯 化 钠 20.0 g 磷酸氢二 钠 12.0 g 磷酸二氢 钾 1.35 g 七叶苷 1.0 g 氯 化 锂 3.0 g 萘啶 酸 钠 0.02 g DB22/T 1607 2012 7 水 1000 mL A.2.1.2 制备 将以上 组份 加 热 溶 解，调节 pH值至 7.2 7.4，分 装，121 高压 灭 菌 15 min。A.2.2 盐酸吖啶黄 溶液 见 A.1.4 A.2.3 柠檬酸铁（）铵 溶液 见 A.1.5 A.2.4 全 培养 基 使 用 前，在 各 个 试管（10 ml）分 别加 0.1 mlA.2.2溶液 和 A.2.3溶液，缓缓 混 合 均 匀。A.3 牛津琼脂（Oxford琼脂）A.3.1 琼脂基础 A.3.1.1 成份 哥伦比亚 琼脂 39 g 七叶苷 1 g 柠檬 酸 铁（）铵 0.5 g 氯 化 锂 15 g 水 1000 mL A.3.1.2 制备 煮沸，使 上 述成 分 完 全 溶 解 于 水 中，调节 pH值至 7.2 7.4，分 装，121 高压 灭 菌 15 min。A.3.2 1000 ml添加 剂 A.3.2.1 成 分 放 线 菌 酮 400 mg 硫 酸 黏 菌 素 盐 20 mg 盐酸 吖啶 黄 素 5.0 mg 头 孢双硫唑甲 氧 2.0 mg 磷 霉素 10 mg 乙醇 5.0 mL 水 5.0 mL A.3.2.2 3.2.2制备 将上 述成 分物质溶 解 于 乙醇/水溶液 中，过 滤除 菌。A.3.3 制备 全 培养 基 DB22/T 1607 2012 8 高压 灭 菌的 琼脂基 础（A.3.1）冷至 47 时，在无 菌 条 件 上加 入 添 加 剂（A.3.2），充 分 混 匀 后到无 菌的 培养皿 中（15 ml/皿），凝固。避 光 保存。A.4 ALOA琼脂 A.4.1 琼脂基础 A.4.1.1 成 分 酪胨 18.0 g 胰 蛋白 胨 6.0 g 酵母浸膏 10.0 g 丙酮 酸 钠 2.0 g 葡萄 糖 2.0 g 甘 油 磷酸 镁 1.0 g 无 水 硫 酸 镁 0.5 g 氯 化 钠 5.0 g 无 水磷酸氢二 钠 2.5 g 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-氨 基 葡 糖 苷 0.08 g 氯 化 锂 10.0 g 琼脂（根据 凝固 程 度）12 g 18 g 水 930 mL A.4.1.2 制备 将上 述 组份 加 入 水 中，煮沸 使 其溶 解。调节 pH值至 7.2 7.4，分 装，121 高压 灭 菌 15 min。A.4.2 萘啶酸钠 溶液 A.4.2.1 4.2.1成 分 萘啶 酸 钠 0.02 g 0.05 ml/L NaOH 溶液 5 mL A.4.2.2 制备 将 萘啶 酸 钠 溶 解 NaOH溶液 中，过 滤除 菌。A.4.3 头孢他啶 溶液 A.4.3.1 成 分 头 孢 他 啶 0.02 g 水 5 mL A.4.3.2 制备 将 头 孢 他 啶 溶 解 于 水 中，过 滤除 菌。A.4.4 硫酸多粘 菌 素 B溶液 DB22/T 1607 2012 9 A.4.4.1 成 分 硫 酸 多粘 菌 素 B 76700 IU 水 5 mL A.4.4.2 制备 将 硫 酸 多粘 菌 素 B溶 解 于 水 中，过 滤除 菌。A.4.5 放线 菌 酮 溶液 A.4.5.1 成 分 放 线 菌 酮 0.05 g 乙醇 2.5 mL 水 2.5 mL A.4.5.2 制备 将 放 线 菌 酮 溶 解 于 乙醇/水溶液 中，过 滤除 菌。A.4.6 补充 液 将 2 g L-磷脂 酰肌醇 溶 于 50 ml冷 水 中，搅拌 30 min，使 溶液 充 分 均 匀，121 高压 15 min，然 后 冷 却 至 48-50。A.4.6.1 成 分 琼脂基 础（A.4.1）930 mL 萘啶 酸 钠 溶液（A.4.2）5 mL 头 孢 他 啶 溶液（A.4.3）5 mL 硫 酸 多粘 菌 素 B溶液（A.4.4）5 mL 放 线 菌 酮 溶液（A.4.5）5 mL 补 充 液（A.4.6）50 mL A.4.6.2 制备 待 琼脂基 础冷至 约 47 时，分 别加 入 上 述 A.4.2至 A.4.6溶液。每只平板 内 加 入 15 ml上 述 新 制备 的 完 全 培养基（A.4.5），凝固，避 光 保存。A.5 胰酪胨大豆 酵 母浸膏琼脂(TSA-YE)A.5.1 成 分 胰酪胨 17.0 g 大豆胨 3.0 g 酵母浸膏 6 g 氯 化 钠 5.0 g 磷酸氢二 钾 2.5 g DB22/T 1607 2012 10 葡萄 糖 2.5 g 琼脂 15 g 水 1000 mL A.5.2 制备 将 各组份 加 热 溶 解，调节 pH值至 7.3 0.2，分 装，121 高 温灭 菌 15 min，备 用。A.6 胰酪胨大豆 酵 母浸膏肉汤(TSB-YE)A.6.1 成份 胰酪胨 17.0 g 大豆胨 3.0 g 酵母浸膏 6 g 氯 化 钠 5.0 g 磷酸氢二 钾 2.5 g 葡萄 糖 2.5 g 水 1000 mL A.6.2 制备 将 各组份 加 热 溶 解，调节 pH值至 7.3 0.2，分 装，121 高 温灭 菌 15 min，备 用。A.7 绵羊 血 琼脂 A.7.1 基础 A.7.1.1 成份 肉 蛋白 胨 30 g 肝消 化 液 2.5 g 酵母浸膏 5 g 氯 化 钠 5 g 琼脂 15 g 水 1000 mL A.7.1.2 制备 将 各组份 和 脱 水基质 加 入 水 中 加 热，如 需 要 调节 pH值 使 其灭 菌 处理 后 25 时 pH值 为 7.3 0.2，分 装 烧瓶。A.7.2 脱纤维绵羊 血 A.7.2.1 组份 琼脂基 础（A.7.1）100 mL 脱纤维 绵羊血（A.7.2）5-7 mL DB22/T 1607 2012 11 A.7.2.2 制备 待 琼脂基 础冷至 47 后，加 入 绵羊血，混 匀。将 适 量培养基 倒 入 无 菌 平 皿，凝固，备 用。A.8 糖 类利 用 肉汤（鼠 李糖和 木 糖）A.8.1 基础 A.8.1.1 组份 蛋白 胨 10 g 牛肉浸膏 1 g 氯 化 钠 5 g 溴甲 酚紫 0.02 g 水 1000 mL A.8.1.2 制备 将 各组份 加 入 水 中 加 热 溶 解（如 必要），如 需 要 调节 pH值 使 其灭 菌 处理 后 25 时 pH值 为 6.8 0.2，分 装 试管，121 高 温灭 菌 15 min。A.8.2 糖溶液 A.8.2.1 组份 糖（鼠 李 糖 和 木糖）5 g 水 100 mL A.8.2.2 制备 各 糖分 别加 入 100 mL水 中 溶 解，过 滤除 菌。A.8.3 全 培养 基 对于 每 种糖，无 菌 条 件下 1倍 体 积 糖溶液（A.8.2）加 入 9倍 体 积 基 础（A.8.1）。A.9 CAMP培养 基 和试验菌 株 本 试 验 会 用 到 绵羊血 平板（A.7）。最 好 用 双 层 琼脂 平板，其 中 一 薄屋 为血琼脂。A.9.1 琼脂基础 见 A.7.1 A.9.2 绵羊 血培养 基 见 A.7.2.2 A.9.3 全 培养 基 将约 10 ml琼脂基 础（A.7.1）加 入 无 菌 培养皿 中，凝固 后 倒 入 一 薄 层 绵羊血培养基（A.10.2），每只 培养皿 不 多 于 3 ml，凝固。如 基 础 培养基 是 以 前 就 准 备 好 的，应 先 置 于 37 温箱 保 温 20 min，然DB22/T 1607 2012 12 后 倒 入 血培养培养基。A.9.4 CAMP反应菌 株 执行 CAMP反 应 需 要-溶血 的金 黄 色 葡萄球 菌（例 如 NCTC 1803或 ATTC 25923）和 马红球 菌（例 如 NCTC 1621或 ATCC 6939），并非所 有 的金 黄 色 葡萄球 菌菌 株 都 适用于 CAMP试 验。将 金 黄 色 葡萄球 菌、马红球 菌、单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克 李斯特氏菌、绵羊 李斯特氏菌 接种 于 TSA-YE斜 面（A.5.2），35 或 37 培养 24 h-28 h，或直 到 开始 生 长，然 后 储 存 于 冰 箱 4 2，至 少 每 月传代 一次。A.10 过氧化氢溶液 应用 3%（m/m），即 将 原 液 10倍 稀释。A.11 磷酸盐缓冲 液（PBS）A.11.1 成 分 Na2HPO4 2H2O 8.98 g 磷酸二氢 钠 2.71 g 氯 化 钠 8.5 g 水 1000 mL A.11.2 配 制 将上 述 组份 溶 解 于 水，调节 pH值 使 其灭 菌 处理 后 25 时 pH为 7.2 0.2，121 高压 灭 菌 15 min。_