ICS 11.020 CCS C 50 13 河北省地方标准 DB 13/T 5861 2023 疾病预防 控制机构 病原微生 物核酸检 测质量管理技 术规范 2023-10-25 发布 2023-11-25 实施 河北省市 场 监督 管 理局 发 布 DB 13/T 5861 2023 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导 则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规定起草。本文件 的某 些内 容可 能涉 及专利。本 文件 的发 布机 构不承 担识 别专 利的 责任。本文件 由河 北省 卫生 健康 委员会 提出。本文件 由河 北省 卫生 健康 标准化 技术 委员 会（HeB/TC 25）归口。本文件 起草 单位：河 北省 疾病预 防控 制中 心、石家 庄市疾 病预 防控 制中 心。本文件 主要 起草 人：李军、姜彩 肖、宋红 梅、曹江 雪、何 宝花、王 伟、冯彤、崔玉杰、刘 继敏、黄卫华、陈 建、李国 风。DB 13/T 58612023 1 疾 病预防 控制机构 病原微 生物核酸 检测质 量管理技 术规范 1 范围 本文件规定了疾病预防控 制机构病原微生物核酸检 测质量管理的基本要求、质量保证、污染控制等内 容。本文件 适用 于疾 病预 防控 制机构 病原 微生 物核 酸检 测质量 管理。2 规范性 引用 文件 下列文件中的内容通过文 中的规范性引用而构成本 文件必不可少的条款。其 中，注日期的引用文件，仅该 日期 对应 的版 本适用 于本 文件；不 注日 期的引 用文 件，其最 新版 本（包 括所 有的 修改 单）适用于 本文 件。GB 19489-2008 实 验室 生 物安全 通用 要求 JJF 1874-2020(自动)核 酸提取 仪校 准规 范 JJG 646-2006 移液 器 RB/T 214-2017 检 验检 测 机构资 质认 定能 力评 价 检 验检测 机构 通用 要求 TSG 21-2016 固定 式压 力 容器 WS 233-2017 病原 微生 物 实验室 生物 安全 通用 准则 YY 0569-2011 II 级生 物 安全柜 YY/T 1173-2010 聚 合酶 链反应 分析 仪 分子诊 断检 验程 序性 能验 证指南 3 术语和 定义 GB 19489-2008、JJF 1874-2020、JJG 646-2006、RB/T 214-2017、WS 233-2017、消 毒技 术规范界定 的及 下列 术语 和定 义适用 于本 文件。实时荧 光定 量PCR 仪 quantitative real-time polymerase chain reaction analyzer 基于聚合酶链式反应原理，通过温度变化循环程序 进行靶互酸片段的体外扩 增，同时对循环过程中荧 光信 号进 行实 施采 集和处 理，定量 或定 性分 析靶核 酸片 段的 仪器。产物分 析 result analysis 判断检 测到 的荧 光强 度是 否能证 实实 验样 本包 含目 标病原 体遗 传物 质的 实验 活动。质量保 证 quality assurance,QA 为满足 核酸 检测 质量 要求 提供充 分可 信性 所必 要的 有计划 的系 统的 措施。4 基本要 求 实验室 设置 4.1.1 疾病预 防控 制机 构核 酸检 测实验 室，应独 立设 置，配备高 压灭 菌区。4.1.2 核酸检 测实 验室 宜参 照 医疗机 构临 床基 因扩 增检 验实验 室管 理办 法 医 疗机构 临床 基因扩增检 验实 验室 工作 导则 布 局建 设；生物 安全 应符 合 GB 19489-2008 中 二级 生物安 全实 验室（BSL-2）或WS 233-2017 中加 强 型 BSL-2 实验 室要 求，并 备案。4.1.3 核酸检 测实 验室 宜设 置以 下区域：试 剂储 存和 准备 区、样 本制 备区、扩 增区、扩增 产物 分 析区。各区域在物理空间上 应是完全相互独立的，无 论是在空间上还是在使用 中，应始终处于完全 分DB 13/T 5861 2023 2 隔状态，不 得有 空气 的直 接相通。使 用实 时荧 光定 量 PCR 仪 时，扩增 区和 扩 增产物 分析 区 可 合并。采用样本处理、核酸提取 及扩增检测为一体的自动 化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物 分析区可 合并。4.1.4 设计为 机械 通风 的核 酸检 测实验 室各 工作 区应 设缓 冲间，人员 通过 缓冲 间进 出 相应的 工作 区。负压工作区，气压由走廊 向缓冲间、核心工作间方 向递减，形成定向气流趋 势；各区之间气压应 由试剂储 存和 准备 区向 样本 制备区、扩 增区、扩 增产 物 分析区 递减，各 区之 间应 设置能 互锁 的传 递窗。各区换 气次 数应 不少 于 10 次/小 时。设施设 备 4.2.1 基本配 置 4.2.1.1 试剂储 存和 准备 区应 配备：a)28 和-20 冰 箱；b)超净工 作台 或生 物安 全柜；c)微量加 样器；d)可移动 紫外 灯；e)离心机；f)混匀器；g)耗材：一次 性手 套、加样 器吸头、锐 器盒、PCR 管（八联 管）、PCR 板；h)专用工 作服 和工 作鞋（套）；i)专用数 据记 录与 传输 设备。4.2.1.2 样本制 备区 应配 备：a)28 冰 箱、-20 或-80 冰 箱；b)离心机；c)混匀器；d)水浴箱 或加 热模 块；e)核酸提 取仪；f)微量加 样器；g)可移动 紫外 灯；h)II 型 生物 安全 柜；i)耗材：一次 性手 套、加样 器吸头（带 滤芯）、锐器 盒；j)专用个 人防 护装 备（依操 作的病 原微 生物 分类 确定）；k)专用数 据记 录与 传输 设备。4.2.1.3 扩增区 应配 备：a)荧光定 量PCR 仪；b)可移动 紫外 灯；c)专用工 作服 和工 作鞋（套）；d)专用数 据记 录与 传输 设备。4.2.1.4 扩增产 物分 析区 应配 备：a)微量加 样器；b)可移动 紫外 灯；c)消耗品：一 次性 手套、加 样器吸 头（带滤 芯）；d)专用工 作服 和工 作鞋（套）；e)专用数 据记 录与 传输 设备。注：本区配置视产物分析方法不同而定。实验室宜根据自己使用的方法或试剂的要求，增加相应的仪器设备。4.2.2 试剂与 耗材 使用部门根据核酸检测需 求，提出申购计划，对试 剂的关键性能参数如精密 度、符合率和检出限等进 行性 能验 证，验证 方法可 参照CNAS-GL039 分子诊 断检 验程 序性 能验 证指南。DB 13/T 5861 2023 3 试剂储存应按照试剂盒存 储要求进行，超出有效期 的试剂与耗材应与有效期 内的试剂耗材分开暂存。暂存期 限不 应超 过 本单位 与医疗 废物 处置 机 构签订 的处理 周期，并分 别按照 化学性 和感 染性医废处 置。4.2.3 质控品 检测过程中需使用试剂盒 自带的质控品和可溯源至 有证标准物质的第三方质 控品。使用需遵守以下原 则：a)严格按 质控 品说 明书 操作；b)冻干质 控品 的复 溶要 确保 所用溶 剂的 质量；c)冻干质 控品 复溶 时所 加的 量要准 确，并尽 量保 持每 次加入 量的 一致；d)冻干质 控品 复溶 时应 轻轻 摇匀，使内 溶物 完全 溶解，切忌 剧烈 震摇；e)质控品 应严 格按 使用 说明 书规定 的方 法保 存，不使 用超过 保质 期的 质控 品；f)质控品 要在 与样 本同 样测 定条件 下进 行测 定。4.2.4 设备检 定/校准 核酸检测涉及的检测设备 应开展周期检定，校准周 期由实验室根据设备的实 际使用情况，选择具有CMA 或CNAS 资质 的检 测 校准机 构，按以 下标 准进 行：a)核酸提 取仪，JJF 1874-2020；b)实时荧 光定 量 PCR 仪，YY/T 1173-2010；c)移液器，JJG 646-2006；d)生物安 全柜，YY 0569-2011；e)高压蒸 汽灭 菌器，TSG 21-2016。校准周期由实验室根据设 备使用情况确定。也可参 考校准证书建议的有效时 长，并在使用前对校准结 果进 行确 认。4.2.5 期间核 查 实时荧 光定 量PCR 仪 在两 次 校准之 间，应对 其控 温系 统和荧 光系 统进 行期 间核 查。检 测人 员应 按照期间 核查 规程 进行 核查，并保 留记 录。应考虑 以下 因素：a)检测/校准 方法 要求；b)实时荧 光定 量 PCR 仪 稳定 性；c)校准周 期；d)历次校 准结 果和 变化 趋势；e)设备维 护保 养情 况。人员 4.3.1 实验室 负责 人 核酸检测实验室应指定专 职或兼职负责人，应具有 中级以上专业技术职称或 同等能力。实验室负责人 全面 负责 技术 运作 和人员 管理，并 指定 负责 人 的代 理人。4.3.2 检测人 员 4.3.2.1 实验室 检测 技术 人员 应具 备实验 室工 作经 历以 及相 关专业 技术 技能，接 受过 核 酸检测 技 能培训，并通过理论考核。上岗前应由实验室负责人 进行能力确认，并由熟悉 检测目的、程序、方 法和结果 评价 的人 员，对检 测人员 进行 监督。4.3.2.2 检测人 员健 康和 培训 管理 应符 合 WS 233-2017 要求。4.3.3 特种作 业人 员 从事压力容器的操作人员 应按照国家有关规定经特 种设备安全监督管理部门 培训，取得国家特种作业 人员 证书，方 可从 事相应 的作 业。DB 13/T 5861 2023 4 4.3.4 档案管 理员 实验室 应设 立专 职或 兼职 档案管 理员，档 案管 理员 职责应 符合WS 233-2017 要求。样本 检测人员应根据样本特点，对样本的接收、流转、保管、处理及样本的识别 等各个环节制定管理和控 制程 序。检测 样本 包含但 不限 于：a)上呼吸 道样 本，包括 鼻咽 拭子、咽拭 子等；b)下呼吸 道样 本，深咳 痰液、肺泡 灌洗 液、支气 管灌 洗液、呼吸 道吸 取物 等；c)便样本/肛 拭子，如 果不 便 于留取 便样 本，可采 集肛 拭子；d)血清样 本，应使 用无 抗凝 剂的真 空釆 血管；e)其他体 液样 本，需采 集脑 脊 液或疱 疹液 进行 检测 的病 原体（如：柯 萨奇 病毒、疱 疹病毒 等）；f)环境样 本，按目 标病 原微 生物相 关防 控方 案采 集；g)食品；h)水。注：用于核酸检测的样本应尽快进行检测，在24小时内检测的样 本可置于4 保存；24 小时内无 法检测的样本则应置于-80 或 以下 保存（如 无-80 保存条件，则 于-20冰 箱暂存）。应设 立专 库或 专柜 单独保 存样 本。5 质量保 证 标准操 作程 序 实验室 应制 定核 酸检 测标 准操作 程序（SOP），并严 格按照SOP 进行 操作。实 验 室自接 到样 本后，应依据SOP 完成 样本 清点 核 对、试 剂准 备、样 本前 处 理、核 酸提 取、核 酸扩 增、产物 分析 及报 告。实验室应 建立 可疑 样本 复检 的流程。样本处 理 5.2.1 人体样 本采 集、运输、存 储应按 照相 应的 病原 体监 测方案、技 术指 南和 标准 进行。针对 不 同种类样本（如全血、血 浆、血清、疱疹液、脑脊液、痰、灌洗液、疱疹液、尿、便等）和不同病 原体，作 出样 本查 验、接收、登记、保存、记 录（指保 存 期间的 相关 技术 参数 如保 存温度、位 置、存取时间、存取 次数 等）、销 毁等的 规定。样 本处 理过 程应按 照核 酸检 测试 剂盒 说明书 要求 进行。5.2.2 食品、环境 和水 等样 本需 按照不 同病 原体 监测 方案 要求，进行 采集，运 输，存储和 检测 前 的样本处 理。核酸提 取 选择磁珠法、膜吸附法等 进行核酸提取，可根据核 酸提取试剂及扩增体系的 要求选择配套的样本采样 管，在生 物安 全柜 内打开 样本 采集 管加 样。按照核 酸提 取试 剂盒 的说 明，继 续核 酸提 取步 骤，核酸提 取完 成后 立即 封盖。聚合酶 链反 应 在生物 安全 柜内 取核 酸加 至PCR 扩增 反应 体系 中。将扩增 体系 放入 实时 荧光 定量PCR 仪，按 照 试剂盒说 明书 设置 扩增 程序，启动 扩增 程序。产物分 析 符合弱阳性质控品能够被 检出，阴性样本对照、水、反应液对照阴性，阳性 对照阳性，阴性对照阴性 要求 的判 定为 本次 核酸检 测过 程合 格，结果 判断如 下：a)无Ct 值、无S 形扩 增曲 线，可报 告阴 性；b)Ct 值 小于 等于 试剂 规定 检 出限，且有 S 形 扩增 曲线，可报 告为 阳性；c)Ct 值 位于 灰区，建 议重 复 实验，若重 做 Ct 值仍 处于 灰区，但出 现明 显 的 S 形 扩增曲 线，该样本 判断 为阳 性，否则 为阴性。注：如使用商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。结果报 告 DB 13/T 5861 2023 5 检测机 构应 按照RB/T 214-2017要 求出 具检 测报 告，有CMA 资质 可加 盖CMA 章，无CMA 资质 可加 盖检验检 测章 或单 位公 章。室内质 控 实验室 应开 展室 内质 控，每 批检测 至少 有1 份弱 阳性 对 照（不高 于检 测试 剂检 出限 的1.5 3倍），13 份阴性对照，分别是 阴性样本对照（可采用本 实验室证实为阴性的标本）、水与反应液对照 和仅反应 液对 照。阴性 对照 和阳性 对照 随机 放入 检测 样本中，参 与扩 增的 全过 程。外部质 控 实验室 应每 年 参 加上 级单 位组织 的考 核或 实验 室间 比对。出现 不符 合结 果时，应采取 纠正 措施，实施纠 正，保持 实验 室检 测能力 满足 检测 任务 要求。6 污染控 制 实验环 境 应定期 对实 验区 域进 行消 毒，可用75%酒精对 实验 室 环境进 行擦 拭消 毒；紫 外 线辐射 消毒；采用去除DNA 污 染的 试剂 对实 验 区域进 行消 毒清 洁，实验 室 地面用 含有 有效 氯1000mg/L 2000mg/L 的 含氯消毒剂 擦拭 或喷 洒消 毒，然后用 拖布 蘸清 水擦 拭残 余消毒 剂，加强 通风。实验设 备 实验结束后，生物安全柜 应以含有有效氯1000mg/L 含氯消毒剂擦拭消毒作用30 分钟，然后，用湿巾擦拭残余消毒剂。或 用75%酒精（75%酒精湿 巾）擦拭消毒，继续通风10 分钟后，开启紫外线消毒30 分 钟。实验 区设 备、物品应 使用 去除DNA 污染 的 试剂喷 洒一 定时 间后，再 用纸巾 进行 擦拭，随 后用75%酒精 喷洒 并用 纸巾 擦 拭干净。医疗废 物 6.3.1 处置原 则 医疗废 物的 处置 应按 照 医疗废 物管 理条 例 和 医疗卫 生机 构医 疗废 物管 理办法 的 要求。6.3.2 医疗废 物收 集 核酸检 测实 验室 应按 以下 要求收 集检 测过 程中 产生 的医疗 废物：a)工作液配制过程 产生的医 疗废物应规范使 用双层黄 色医疗废物收集 袋封装，转移至高压 灭菌区。b)核酸提 取过 程产 生的 废物 规范使 用双 层黄 色医 疗废 物收集 袋封 装，用含 有效 氯 1000mg/L 2000mg/L 的含 氯消 毒剂 喷 洒表面 转移 至高 压灭 菌区。c)扩增完成后，反 应管不可 开盖，应规范使 用双层黄 色医疗废物收集 袋封装，转移至高压 灭菌区。6.3.3 医疗废 物高 压处 置 核酸检 测实 验室 收集 的医 疗废物 经高 压蒸 汽灭 菌器121 30分 钟高 压后，按 类 别黏贴 标识，注明核酸 检测 实验 室，医废 种类、数量 等，转移 至医 疗废物 临时 集中 存放 处。6.3.4 交接 核酸检测实验室应与临时 集中存放处管理部门进行 医疗废物交接，填写实 验室废物交接登记表，一式 两份，双 方各 存一份。6.3.5 转运 临时集 中存 放处 管理 部门 与取得 资质 的医 废无 害化 处置单 位签 订医 废处 置合 同，定 期转 运。个人防 护 DB 13/T 5861 2023 6 实验室应配备二级以上个 人防护用品。实验室对个 人防护用品的选择、使用、维护应有明确的程序和使用指导，可 根据 病原微生物危害等级分类，采取相应防护措施。检 测人员需充分了解其 实验工作的性质和特点，接 受防护装备的使用培训，并正确使用个体防护装备。有特殊规定的按其 要求执行。实验操 作 实验操 作应 符合GB 19489-2008附录B 和附录C的 要求，应 避免 发生 污染 实验 环 境、危及 自身 和他人安全、破 坏样 本以 及不 必要的 操作。清洁用 具 不同的 实验 区域 应有 其各 自的清 洁用 具。基本 原则 是，由 清洁 区向 污染 区进 行，洁 具不 可交 叉。清洁消 毒顺 序依 次为 试剂 储存和 准备 区、样本 制备 区、扩 增区、扩 增产 物分 析区。DB 13/T 5861 2023 7 参考文 献 1中华人民共和国国务 院.病原微生物实验室生 物安全管理条例国务 院令第424号，北京：中华 人民 共和 国国 务院，2004-11-12.2 中 华人 民共 和国 卫生 部.医 疗机 构临 床基 因扩 增检验 实验 室管 理办 法 卫办医 政发 2010 194号，北京：中 华 人 民 共和国 卫生 部，2010-12-06.3 中华 人民 共和 国国 务 院.特种 设备 安全 监察 条 例 国务 院令 第373 号，北京：中 华人民共和 国国 务院，2003-06-01.4 中华 人民 共和 国国 务 院.医疗 废物 管理 条例 国务 院令 第380 号，北 京：中 华人 民共和国国 务院，2003-06-16.5 中华 人民 共和 国卫 生 部.医疗 卫生 机构 医疗 废 物管理 办法 卫 生部 第36 号，北京：中华人民 共和 国卫 生部，2003-10-15.6 国务 院应 对新 型冠 状 病毒肺 炎疫 情联 防联 控机 制综合 组.新 型冠 状病 毒 肺炎防 控方 案（第九版）联防 联控 机制 综 发 2022 71号，北京：国务院 应对 新型 冠状 病毒 肺炎疫 情联 防联 控机制综合 组，2022-06-27.