ICS 65.100.10 B 65 备案号：37440-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1782 2013 布氏白僵菌粉剂生产技术规程 Technical regulations for powder production of Beauveria brongniatii 2013-04-01发布 2013-06-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1782 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。本标准由吉林省林业厅提出并归口。本标准起草单位：吉林市林业科学研究院。本标准主要起草人：张海军、陈玉宝、王有菊、王江、李茂军。DB22/T 1782 2013 1 布氏白僵菌粉剂生产技术规程 1 范围 本标准规定了布氏白僵菌一级菌种生产，二级菌种生产，菌剂生产，菌剂干燥、粉碎、包装、储藏，及质量检验等技术内容。本标准适用于布氏白僵菌粉剂生产。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是 注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本适用于本文 件。凡是不 注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包 括所 有的 修改 单）适用于本文件。GB/T 25864-2010 球孢 白僵菌粉剂 NY/T 883-2004 农 用 微 生 物 菌剂生产技术规 程 3 术语和定义 下列术 语和 定 义 适用于本文件 3.1 布氏白僵菌 beauveria brongniatii(Sacc.)Petch 又名卵孢 白僵菌，一种 半知 菌 类 的 虫 生 真 菌，分类上属 于 真 菌 门（Eumycota），半知 菌 亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hyphomycetes），丛梗孢目（Moniliaceae），丛梗孢 科（Moniliaceae）、白僵菌 属（Beauveria）。3.2 原种 stock culture 习惯上称“母 种”，由 固体培养基培养保 藏的 原始纯化 菌种。4 一级菌种生产 4.1 培养基 马铃薯 200 g切块（1 cm 1 cm 1 cm）煮沸 30 min，过滤，取滤液，定容 至 1000 ml，加入琼脂 20 g，全部溶解后加蔗糖或葡萄糖 20 g、牛肉膏 1 g、蛋 白 胨 1 g，煮至完全融化；用 盐酸或氢氧化 钠调 解 pH至 5。4.2 分装 按 每试管 10 ml定量 分 装 至 20 mm 200 mm试管中；用 纯 棉棉塞封盖试管 口，松紧 适 度。DB22/T 1782 2013 2 4.3 灭菌 试管直立 于 高压灭 菌 锅中，灭 菌 温度 121 126，压力 0.1 Mpa 0.15 Mpa，时间 30 min。4.4 摆制斜面 灭 菌 后，在无 菌 室 的 桌面 上 立即摆放斜面，原 则是 在 培养基 不 湿棉塞 的 情况 下，尽 量 延长 培养基 的斜面长度；斜面 培养基 凝 固后 即 可 接 种。4.5 接种 在无 菌 条 件下，取 下 原 种 试管 和 一级 斜面 培养基 试管棉塞，酒精灯火焰烧灼试管管 口 3 s 5 s，用无 菌 接 种 针挑 取原 种 25 mm2 50 mm2，接 种于一级 斜面 培养基上，用 接 种 针轻轻来回拉动 2 次 3 次，在酒精灯火焰前，用 原 棉塞封盖试 验 管 口。4.6 一级菌种培养、保存 在 25 恒温 培养 箱中 培养 10 d 12 d，观察剔除污染试管；保 存在 4 5 冰箱中备 用。4.7 菌种复壮 4.7.1 复壮条件 复壮条 件应 参 照 NY/T 883-2004中 4.1.5条执行。4.7.2 复壮方法 在暗室，30 W紫外灯，距 菌种 表面 30 cm，照 射 30 min，保 持黑暗 24 h，重 新 接 种。5 二级菌种生产 5.1 培养料配制 按 麦麸、稻糠 和 谷糠 5：3：2的 比例混合，用 0.1%KmnO4水 溶液 按 与 培养 料 质量 比 1：1的 比例 搅拌均 匀。5.2 分装 将 培养 料 装 入 600 ml普通 培养 瓶，装 瓶 至 容 积 的 2/3，用 耐 高温 聚丙烯塑 料 薄膜 封 口。5.3 灭菌 灭 菌 温度 121 126，压力 0.1 Mpa 0.15 Mpa，时间 30 min。5.4 接种 灭 菌 12 h后，在 超净工作台 上，用 无 菌 接 种 针，按 每 支 一级菌种 试管接 7 瓶 9 瓶 的 数 量，将 一级 菌种 迅速移 至 二级 瓶 中，并 封盖。5.5 振荡 接 种 后 振荡，使 培养 料 均匀散开 并 使 菌种 均匀 分 布于 培养 料 内。5.6 培养条件 DB22/T 1782 2013 3 在无 阳光 直射，23 25 的 条 件下 培养 8 d 10 d。6 菌剂生产 6.1 消毒 培养 室 按 5 g/m3高 锰 酸 钾 加 10 ml福尔 马 林的用量，进 行 熏蒸消毒 12 h；培养 盘 及 塑 料 薄膜浸 入 0.1%高 锰 酸 钾 水 溶液 中 消毒 1 h，擦拭 干 净 备 用。6.2 培养料配制 同 5.1。6.3 培养料装袋 装于规 格为 30 cm 20 cm耐 高温 聚丙烯 菌 袋 中，每 袋 装 培养 料 400 g 500 g，折叠袋 口。6.4 灭菌 将 培养 料 袋 分 层置 于 高压灭 菌 锅中，灭 菌 温度 121 126，压力 0.1 Mpa 0.15 Mpa，时间 35 min。6.5 接种 灭 菌 12 h后，在无 菌 条 件下，按 每 瓶 二级菌 接 种 1 kg培养 料 充 分 混合 进 行 扩繁。6.6 装盘、培养 培养 盘 下 铺塑 料 薄膜，将 培养 料 装 入培养 盘 中，装 至 平盘，上 盖 塑 料 薄膜。置 于 无 阳光 直射 23 25 培养 室 的 培养 架 上培养 5 d 6 d。7 菌剂干燥、粉碎、包装和储藏 7.1 干燥、粉碎 在无 阳光 直射、通风 的 室 内 阴 干 或 用 恒温 干燥 箱 30 快速烘 干；干燥的标准 为含 水 率 10%。采 用 40 目 筛片 的 电 动 粉碎 机 粉碎。7.2 包装、储藏 采 用 密 封 塑 料 袋 封 装，以 每 袋盛 装菌剂 5 kg为宜，外 套编织袋；在 干燥、避光 条 件下储藏，8 以下储藏 期 不 超 过 6 个月。8 质量检验 8.1 抽样 抽样方法 应 参 照 GB/T 25864-2010中 5.1条执行。8.2 含水率测定 含 水 率测 定 方法 应 参 照 GB/T 25864-2010中 5.5条执行。DB22/T 1782 2013 4 含 水 率 标准 为 10%。8.3 含孢量测定 含 孢 量 测 定 方法 应 参 照 GB/T 25864-2010中 5.3条执行。含 孢 量 100 亿/g。8.4 活孢率测定 准 确 称取蛋 白 胨 0.5 g、蔗糖 0.5 g、磷 酸氢 二 钾 0.1 g，倒 入 250 mL锥形瓶 中，用 蒸馏 水 定容 至100 mL，放 入 待测 菌粉 0.2 g，振荡 2 min，将 混合 菌 液 滴 在 清 洁 的 载玻 片 上，将 载玻 片 放 入 垫 有 湿 滤 纸的 培养 皿 中，置 于 25 恒温箱中 培养 16 h 20 h，盖 上 盖 玻 片，600倍显 微 镜镜 检；芽 管 大 于 孢 子 半 径 的 孢 子 为 萌发 孢 子；查 数 10个 视野萌发芽 孢 子 数 和 检 查 孢 子总 数；按（1）公式计算 孢 子萌发 率：%100=MNR.(1)式 中：R 孢 子萌发 率,%；N萌发 孢 子总 数；M 检 查 孢 子总 数。每 个样 品设 3个 重复，取 3个 重复 均 值 作为 该批 次 菌粉的 活 孢 率。储藏 期 6个月 时，活 孢 率 80%。DB22/T 1782 2013 5 A A 附 录 A（资料性附录）布氏白僵菌 形态特征图表 中 名 学 名 菌 落特征 菌 丝 特征 孢 子特征 色素特征 布氏白僵菌 Beauveria brongniatii(Sacc)Petch 表面 乳 白 色 至淡黄色，菌 落茸毛状 或 棉 絮状，培养 的 后期 变为 粉 状。无 色、透明、有 横隔 膜，直 径 为 1.5 m 2.0m。分 生 孢 子椭圆 形 至亚 圆形，直 径 2.0 m 6.0 m 1.5 m 3.0 m，生于产 孢 细胞顶端 所延 伸 的“Z”字 形 丝 状器上。使 明胶 培养基 底 部 呈深红色 至 紫色；有的菌 丝 能使 PDA培养基 呈浅 紫 色。图 A.1 布氏白僵菌 形态特征图表 _