1I C S 6 5.0 2 0.3 0C C S B 4 121辽 宁 省 地 方 标 准D B 2 1/T 3 8 7 9 2 0 2 3动 物 弓 形 虫 病 荧 光 免 疫 层 析 试 纸 条 检 测 技术 规 程I n s p e c t i o n s p e c i f i c a t i o n f o r f l u o r e s c e n t i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i c d e c t e c t i o n o ft o x o p l a s m o s i s i n a n i m a l s2 0 2 3-1 1-3 0 发 布 2 0 2 3-1 2-3 0 实 施辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 2 1/T 3 8 7 9 2 0 2 3I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规定 起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 辽 宁 省 农 业 农 村 厅 提 出 并 归 口。本 文 件 起 草 单 位：沈 阳 农 业 大 学、辽 宁 伟 嘉 农 牧 生 态 食 品 有 限 公 司。本 文 件 主 要 起 草 人：杨 娜、桑 晓 宇、冯 颖、刘 攀 峰、邓 亮、陈 冉、杨 作 丰、李 红 魁、范 治 斌、薛 英、李 德 臣、李 佳 祺、王 英。本 文 件 发 布 实 施 后，任 何 单 位 和 个 人 如 有 问 题 和 意 见 建 议，均 可 以 通 过 来 电 和 来 函 等 方 式 进 行反 馈，我 们 将 及 时 答 复 并 认 真 处 理，根 据 实 际 情 况 依 法 进 行 评 估 及 复 审。归 口 管 理 部 门 通 讯 地 址：辽 宁 省 农 业 农 村 厅（沈 阳 市 和 平 区 太 原 北 街 2 号），联 系 电 话：0 2 4-2 3 4 4 7 8 6 2。文 件 起 草 单 位 通 讯 地 址：沈 阳 农 业 大 学（沈 阳 市 沈 河 区 东 陵 路 1 2 0 号），联 系 电 话：0 2 4-8 8 4 8 7 0 5 3。D B 2 1/T 3 8 7 9 2 0 2 31动 物 弓 形 虫 病 荧 光 免 疫 层 析 检 测 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 动 物 弓 形 虫 病 荧 光 免 疫 层 析 检 测 技 术 规 程，包 括 规 范 性 引 用 文 件、原 则、仪 器 与试 剂、样 品 采 集 与 处 理、检 测、结 果 计 算、判 定 标 准。本 文 件 适 用 于 动 物（猪、猫 等）血 清 中 弓 形 虫 抗 体 水 平 的 快 速 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。N Y/T 5 4 1 兽 医 诊 断 样 品 采 集、保 存 与 运 输 技 术 规 范3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。4 原 则基 于 双 抗 原 夹 心 荧 光 免 疫 层 析 法，将 待 检 血 清 样 品 加 入 弓 形 虫 荧 光 免 疫 层 析 试 纸 卡 样 品 垫 上，通 过 虹 吸 作 用 沿 层 析 条 侧 向 流 动，在 检 测 区 被 检 测，如 果 是 阳 性，则 T 线（注：T 线 为 检 测 线）出现 条 带；如 果 是 阴 性，则 T 线 无 条 带；另 外，如 果 C 线（注：C 线 为 质 控 线）出 现 说 明 试 纸 条 是有 效 的，否 则 无 效。将 试 纸 卡 放 入 荧 光 免 疫 分 析 仪 中，通 过 测 定 荧 光 信 号 强 度，可 以 对 抗 体 滴 度 进行 定 量 分 析。5 仪 器 与 试 剂5.1 仪 器5.1.1 荧 光 免 疫 分 析 仪激 发 波 长 为 3 6 5 n m 5 n m，检 测 波 长 为 6 1 0 n m 5 n m。5.1.2 单 道 可 调 移 液 器D B 2 1/T 3 8 7 9 2 0 2 321 0 L 1 0 0 L，0.5 L 1 0 L。5.1.3 分 析 天 平最 小 分 度 值 为 0.0 0 1 g。5.1.4 离 心 机离 心 速 度 3 0 0 0 r p m/m i n。5.1.5 冰 箱2 8，2 0。5.2 试 剂5.2.1 样 品 稀 释 液见 附 录 A。5.2.2 弓 形 虫 荧 光 免 疫 层 析 试 纸 卡荧 光 微 球 标 记 的 弓 形 虫 重 组 抗 原 和 鸡 I g Y 埋 置 在 标 记 物 垫 内；硝 酸 纤 维 素 膜（N C 膜）的 测 试 线（T 线）和 控 制 线（C 线）分 别 包 被 弓 形 虫 重 组 抗 原 和 羊 抗 鸡 I g Y 的 I g G（备 注：荧 光 微 球 标 记 垫 里 需要 另 外 标 记 一 种 与 弓 形 虫 抗 原 无 关 的 抗 原 物 质，在 此 选 用 鸡 的 I g Y，因 此 在 硝 酸 纤 维 素 膜 上 的 控 制线 位 置 就 标 记 上 抗 鸡 I g Y 的 抗 体 I g G，I g Y 与 I g G 结 合 反 应，C 线 就 出 现 条 带，说 明 试 纸 条 是 合 格 的）。（见 图 1）图 1 荧 光 免 疫 层 析 试 纸 卡 结 构 样 品 垫；P V C 底 板；待 检 血 清 样 品；标 记 物 垫；测 试 线（T 线）；控 制 线（C 线）；N C 膜（硝 酸 纤 维 素 膜）；吸 水 滤 纸6 样 品 采 集 与 处 理D B 2 1/T 3 8 7 9 2 0 2 336.1 样 品 的 采 集按 照 N Y/T 5 4 1 中 的 规 定 进 行，并 做 好 安 全 防 护。按 常 规 方 法 用 干 燥、洁 净 的 无 抗 凝 剂 的 离 心 管或 适 当 容 器 采 集 3 m L 5 m L 的 血 液。6.2 样 品 的 处 理血 液 样 本 用 离 心 机 3 0 0 0 r p m/m i n 离 心 3 m i n 5 m i n，分 离 血 清，血 清 量 不 少 于 5 0 0 L。6.3 样 品 的 贮 存血 清 样 品 在 2 8 条 件 下 保 存 应 小 于 2 4 h。如 需 长 期 保 存 应 置 于 2 0 条 件 下，避 免反 复 冻 融。7 检 测7.1 样 本 稀 释将 弓 形 虫 荧 光 免 疫 层 析 试 纸 和 待 检 血 清 样 品 回 温 至 2 5 左 右。将 待 检 血 清 样 本 先 用 样 品 稀 释 液进 行 3 倍 稀 释，即 1 份 待 检 血 清 样 品 与 2 份 样 品 稀 释 液 混 合（例 如，7 5 L 待 检 血 清 样 品 与 1 5 0 L样 品 稀 释 液 混 合）。7.2 加 样将 荧 光 免 疫 层 析 检 测 卡 放 于 干 净 平 坦 的 台 面 上，用 移 液 器 吸 取 已 经 稀 释 好 的 7 5 L 待 检 血 清 样本，垂 直 加 样 于 检 测 卡 的 加 样 孔 内。7.3 荧 光 检 测室 温 静 置 1 5 m i n，立 即 采 用 荧 光 免 疫 分 析 仪 检 测，测 定 T 线 和 C 线 荧 光 信 号，读 取 分 析 仪 显 示 数值，该 数 值 即 为 抗 体 效 价。7.4 有 效 性 控 制7.4.1 空 白 对 照将 荧 光 免 疫 层 析 检 测 卡 放 于 干 净 平 坦 的 台 面 上，用 移 液 器 吸 取 样 品 稀 释 液 7 5 L 于 检 测 卡 的 加样 孔 内，如 果 控 制 线（C 线）检 测 到 荧 光 信 号，试 验 结 果 有 效；否 则，试 验 无 效。7.4.2 阴 性 对 照D B 2 1/T 3 8 7 9 2 0 2 34将 荧 光 免 疫 层 析 检 测 卡 放 于 干 净 平 坦 的 台 面 上，用 移 液 器 吸 取 稀 释 液 稀 释 好 的 阴 性 血 清 7 5 L于 检 测 卡 的 加 样 孔 内，如 果 控 制 线（C 线）检 测 到 荧 光 信 号，试 验 结 果 有 效；否 则，试 验 无 效。7.4.3 阳 性 对 照将 荧 光 免 疫 层 析 检 测 卡 放 于 干 净 平 坦 的 台 面 上，用 移 液 器 吸 取 稀 释 液 稀 释 好 的 阳 性 血 清 7 5 L于 检 测 卡 的 加 样 孔 内，如 果 控 制 线（C 线）和 检 测 线（T 线）检 测 到 荧 光 信 号，试 验 结 果 有 效；否 则，试 验 无 效。8 结 果 计 算An（n=1,2,3,4,5）-荧 光 免 疫 分 析 仪 读 取 标 准 品 溶 液 的 检 测 卡 上 的 荧 光 信 号 的 T/C 值。以 标 准 品 溶 液 的 T/C 值 的 对 数 为 纵 坐 标，以 弓 形 虫 抗 体 阳 性 血 清 效 价 的 对 数 为 横 坐 标，绘 制 标准 曲 线 图。将 待 测 样 本 的 荧 光 信 号 的 T/C 值 代 入 标 准 曲 线 中，从 标 准 曲 线 上 读 出 所 对 应 的 样 本 的 弓形 虫 抗 体 效 价。注：软 件 自 带 计 算 功 能，能 准 确 算 出 当 前 样 本 荧 光 信 号 的 T/C 值 所 对 应 的 弓 形 虫 抗 体 效 价。9 判 定 标 准被 检 血 清 抗 体 效 价 1:1 2 8 时，判 为 阳 性；被 检 血 清 抗 体 效 价 1:6 4 时，判 为 阴 性；被 检 血 清抗 体 效 价 1:6 4 1:1 2 8 时，判 为 可 疑。D B 2 1/T 3 8 7 9 2 0 2 35附 录 A（资 料 性）样 品 稀 释 液A.1 样 品 稀 释 液 成 分N a2H P O4 1 2 H2O 4.0 2 gN a H2P O4 2 H2O 0.6 6 gN a C l 9 gP r o c l i n 3 0 0 1 m L吐 温 2 0（T w e e n-2 0）1 m L双 蒸 水 1 LA.2 制 法将 N a2H P O4 1 2 H2O、N a H2P O4 2 H2O、N a C l 同 时 放 入 装 有 8 0 0 m L 双 蒸 水 的 1 L 烧 杯 中 搅 拌 融 化，再加 入 P r o c l i n 3 0 0 混 匀，然 后 加 入 吐 温 2 0 混 匀，最 后 用 双 蒸 水 将 烧 杯 溶 液 定 容 至 1 L。A.3 储 存配 置 好 的 样 品 稀 释 液 分 装，置 于 2 8 保 存 备 用，储 存 时 间 不 超 过 1 4 天。