ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 3259 2023 羊肝细胞 体外培养 技术规程 The code of practice on cells of lamb hepatic in vitro culture 2023-12-15 发布 2024-01-15 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 3259 2023 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由 内 蒙古 自治 区农 牧业科 学院 提出。本文件 由 内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本文件 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院。本文件 主要 起草 人：孙海 洲、桑 丹、金鹿、刘 秀梅、张春 华、杨鼎、张 崇志、李胜 利、王博、萨 初拉、刘 威、宝华、胡 晓晓、李文 婷、付乐。DB15/T 3259 2023 1 羊肝细胞 体外培 养技术规程 1 范围 本 文件 规定 了羊 肝细 胞体 外培养 技术 规程 的程 序确 立、工 作区 条件 和方 法。本 文件 适用 于羊 的肝 细胞 体外培 养。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。肝细胞 体外 培养 in vitro culture of hepatic cells 以羊肝 脏组 织为 材料，经 体外培 养、分离 出呈 圆球 形、分 散状 态细 胞的 过程。4 设施设 备 工作区 应包 括准 备室、缓 冲间、无菌 室及 细胞 保存 室。无菌室 应配 备超 净工 作台、紫外 灯、酒精 灯、二氧 化碳培 养箱 等相 关设 备。细胞保 存室 应配 备冰 箱、超低温 冰箱 和液 氮罐 等设 备。5 方法 试剂与 溶液 配制 5.1.1 如无特 别说 明，所用 试剂 均为分 析纯。5.1.2 本标准 所用 水，一律 应符 合 GB/T 6682 中 三级 水。5.1.3 磷酸氢 二钠、氯化 钠、盐 酸、氯 化钙、氯化 钾、氢 氧化钠、磷酸 氢二 钾、氢 氧化钾、葡萄 糖、乙二胺 四乙 酸二 钠、地塞 米松、罗斯 韦尔 公园 纪念 研究 所 1640 培 养基（RPMI1640）、4-(2-羟乙 基)-1-哌嗪乙 磺酸（HEPES）、磷 酸盐缓 冲溶 液（PBS）、胎 牛血清、胰 岛素、青 霉素、链霉 素、型 胶原 酶及0.4%台 盼蓝 溶液。5.1.4 肝素钠：将1 g 肝素 钠溶 解于20 mL 水中，用0.22 m 滤膜 过滤 除菌，分 装 并保存 于-20 冰箱中备 用。DB15/T 3259 2023 2 5.1.5 型胶 原酶：准 确称 取 50 mg 的 型胶 原酶 粉末 溶 解于 1 mL 的 基础 培养 液中，用 0.22 m 滤膜过滤 除菌，即 可配 制 成50 g/L 的 型 胶原 酶，配 置完成 后立 即使 用。5.1.6 双抗：准确 称 取 1 g 链霉 素和0.625 g 青 霉素，充 分溶解 于200 mL 的水 中，用0.22 m 滤膜过滤除 菌，分装 并保 存于-20 冰箱 中备 用。5.1.7 胰岛素 母液：50 mg 胰岛 素 溶解 于20 mL 浓度为 0.01 mmol/L 的 盐酸 溶液 中，配 制成 4.36 mol/L10-4mol/L 的 胰岛 素母 液，用 0.22 m 滤膜 过滤 除 菌，分 装并 保存 于-80 冰箱中 备用。5.1.8 Percoll 细 胞分 离液：取27 mL Percoll 液，加入3 mL PBS 液（10）混 匀，再从混 匀的 液体中取9 mL 加入15 mL PBS（1），与离 心后 的肝 细 胞沉淀 混合。5.1.9 灌流液 A：准 确称 取 8.1816 g 氯化 钠、0.4995 g 氯 化钾、2.3831 g HEPES、0.4500 g 葡萄 糖和0.1861 g 乙 二胺 四乙 酸 二钠，溶于800 mL 水 中，加水定 容 至 1000 mL。用 1 mmol/L 盐 酸或l mmol/L氢氧化 钠调 整 pH 值为 7.2。在无 菌超 净工 作台，按 1:100 mL 加入 双抗，用 0.22 m 滤膜 过滤 除菌，4 保 存备 用，使用 前 37 预 热。5.1.10 灌流 液B：准确 称取8.1816 g 氯 化钠、0.4995 g 氯 化钾、6.8493 g HEPES、0.4500 g 葡萄糖和0.5550 g 氯化 钙，溶 于 800 mL 水中，加 水定 容 至 1000 mL。用 0.22 m 滤 膜过滤 除菌，4 保 存备用，使用 前37 预热。5.1.11 灌流 液C：在灌 流液B 的 基础上，每500 mL 灌流液 B 加入 2 mL 的50 g/L 的 IV 胶原 酶母 液，使其含 有0.2 g/L 的IV 胶原 酶。用0.22 m 滤膜 过 滤除菌，现 配现 用，使用 前 37 预 热。5.1.12 RPIM1640 基础 培养 液：将 一袋 RPIM1640 粉末 培养 基 于1 L 超 纯水 中，加 入 2.0 g 碳酸 氢钠调节 pH 值，用 0.22 m 的过滤 器过 滤除 菌，放 4C 冰箱冷 藏备 用。5.1.13 RPIM1640 贴壁 培养 液：在 每 200 mL RPIM1640 基 础 培养液 中加 入 20 mL 胎牛 血清、10-6 mol/L的胰岛 素0.460 mL、10-6 mol/L 的地 塞米 松16 L、双抗 2 mL，5 mg/mL 的维 生素C 8 L。用 0.22 m滤膜过 滤除 菌，分装 封口，4 保存 备用。5.1.14 RPIM 1640 生长 培养 液：在 RPIM1640 基 础培 养液 中添 加 5%的胎 牛血 清和 1%双抗。用0.22 m滤膜过 滤除 菌，分装 封口，4 保存 备用。5.1.15 冻存液：将 胎牛 血清、DMSO 及 RPMI1640 培 养液 按 2:1:7 比例 混合，用 0.22 m 滤膜 过滤 除菌，现 配现 用。培养方 法 5.2.1 肝细胞 分离 及培 养 5.2.1.1 羊空 腹 24 h 后 侧卧 保定，腹部 剪毛 消毒 后静 脉麻 醉，静 脉注 射每 千克 体 重 1500 IU 的肝 素钠。剖 开腹 腔无 菌取 肝脏 尾状突 约 40 g，置 于无 菌 器皿内 迅速 将其 转入 细胞 间。5.2.1.2 清洗肝 脏尾 状突 表面 血迹，对切 面进 行修 整使 血管 充分暴 露，切面 的血 管数 一般 为 2 3 个。调整肝 脏尾 状突 抓握 方式，将 灌流 管一 端插 入其 中 的一个 血管 口，用 手指 将 另外两 个血 管口 堵严，以 防灌注时 灌流 液滴 洒，另一 端灌注 灌流 液。5.2.1.3 灌注灌 流 液A，灌注 液流 速约 为50 mL/min，持续10 min 15 min。5.2.1.4 灌注灌 流 液B，灌注 液流 速约 为50 mL/min，随 着 灌流液 的注 入，肝脏 尾状 突逐渐 变得 充盈，尾状突 由中 间至 四周 从暗 红色变 至棕 白色，流 出的 灌流液 由血 色变 澄清。5.2.1.5 灌注灌 流 液C，灌注 液流 速约 为20 mL/min，尾状 突 逐渐 变软，且 流出 的灌 流液逐 渐混 浊。5.2.1.6 将尾状 突移 入无 菌平 皿中，加入 20 mL 50 mL 胎牛 血清，轻轻撕 掉肝 脏被 膜，将血 管、脂 肪和结缔 组织 去除，剪 去周 边未被 消化 部分。5.2.1.7 收集被 消化 的肝 脏乳 糜组 织，剪碎 较大 的肝 组织，分别 用 100 目(150 m)、200 目(75 m)及 500 目(30 m)细 胞筛 过 滤消化 后的 肝组 织。DB15/T 3259 2023 3 5.2.1.8 收集肝 细胞 悬液，用 500 r/min 冷冻 离心 机离 心 5 min 10 min，弃 上清 液用RPMI1640 生长培养液 清 洗23 次，用RPMI1640 贴 壁培 养液 重悬，0.4%台盼 蓝检 测细 胞活 率，血 细胞 计数 板计 数。5.2.1.9 用贴壁 培养 液将 细胞 悬液 调整 为 2.6 个/mL 106个/mL 密 度，接 种于 六孔 培养 板中每 孔 2 mL，置于二 氧化 碳培 养 箱 37、5%CO2 条 件下 培养。5.2.1.10 4 h 后 换成 生长 培养 液，以 后每 2 d 更换 一次 培养液，并对 肝细 胞形 态及 生长 情况进 行跟 踪记录。5.2.2 肝细胞 纯化 5.2.2.1 将肝细 胞悬 液 用 RPMI1640 生长培 养液 清 洗 2 3 次，500 r/min 冷 冻离 心机 离 心 5 min 10 min，弃上 清液。5.2.2.2 用Percoll 细胞 分离 液重 悬肝细 胞，2000 r/min 冷 冻离心 机离 心 10 min，收 集中间 层的 细胞得到纯 化的 肝细 胞。5.2.2.3 用RPMI1640 生 长培 养液 重 悬，500 r/min 冷冻 离心 机 离心 3 min，洗 涤2 次。最 后以 RPMI1640生长培 养液 重悬 肝细 胞制 成纯化 的肝 细胞 悬液 备用。5.2.3 肝细胞 冻存 5.2.3.1 在细胞 汇合 前，将细 胞同 培养液 一同 吸出，放 入 4 mL 离 心管 中。5.2.3.2 在培养 皿中 加 入 1 mL 胰 蛋 白酶溶 液进 行消 化，摇 晃45 次，使胰 蛋白 酶溶 液 与细胞 充分 接触。5.2.3.3 1000 r/min 离心 5 min，吸出含 酶的 上清 溶液。5.2.3.4 将细胞 生长 面洗 脱，用 1.5 mL 培养 液再 次悬 浮，1000 r/min 离心5 min，再用 1 mL 冻 存液重新悬 浮细 胞。5.2.3.5 加入适 量冻 存液，为 冻存 做准备。5.2.3.6 将1 mL 冻 存液 悬浮 的细 胞 移至 1.5 mL 离 心管 中，用 脱脂棉 将冻 存管 包好 后放 入样品 袋中，管口朝 上放 入4 冰 箱 2 h 左右，取 出放 入-20 冰箱过 夜，次日 将其 移至-80 冰 箱中 过夜，最 后投入液 氮罐 中保 存。5.2.4 肝细胞 复苏 5.2.4.1 将冻存 管 于 37 水 浴锅 中迅速 解冻，待含 有细 胞 的冻存 液彻 底溶 化后 取出 移至超 净工 作台。5.2.4.2 用RPMI1640 培 养液 稀释，400 r/min 离心 5 min，弃 上清液，加 入培 养液 吹打 均匀，用移液器将细 胞移 入加 有培 养液 的培养 皿中，放 入 37、5%CO2 恒温 培养 箱中 培 养。5.2.5 肝细胞 传代 5.2.5.1 当细胞 铺满 培养 皿底 约 80%后，将培 养皿 移入 超净 工 作台，倒掉 培养 皿内 培养 液。5.2.5.2 向培养 皿中 加 入 0.25%胰 蛋白酶，37 消化1 min 至80%的细 胞脱 壁。5.2.5.3 细胞重 悬后，将 一半 转入 新培养 皿中，分 别补 加 含 20%胎牛 血清 的 RPMI1640 生 长培养 液，置于37、5%CO2 恒温 培养 箱中静 置培 养。羊肝 细胞 体外培 养程 序流 程图 参见 附录 A。DB15/T 3259 2023 4 A A 附录A（资料 性）羊肝细 胞体 外培 养程 序流 程图 羊肝细 胞体 外培 养程 序流 程图参 见图A.1。图A.1 羊肝 细胞 体外 培养 程序 流 程图 羊只处 理（见5.2.1.1）收集过 滤消 化后 的肝 组织（见5.2.1.7）灌注灌 流液（见5.2.1.3、5.2.1.4、5.2.1.5）去除结 缔组 织（见5.2.1.6）肝脏取 样后 预处 理（见5.2.1.2）离心、重悬 细胞（见5.2.1.8）接种、培养（见5.2.1.9、5.2.1.10）肝细胞 分离 及培 养（见5.2.1）肝细胞 传代（见5.2.5）肝细胞 复苏（见5.2.4）肝细胞 冻存（见5.2.3）肝细胞 纯化（见5.2.2）DB15/T 3259 2023 5 参考文 献 1 冯振月,刘德福,宋佰芬等.牛肝脏细胞体外培养和传代细胞的初步鉴定J.中国细胞生物学学报，2019，41(01):80-86.2 陈 阳 洁,高 柯 欣,王 智 豪 等.肝 实 质 细 胞 的 分 离、鉴 定 及 原 代 培 养J.畜 牧 与 饲 料 科学,2019,40(04):7-11.3 张钰,付亮,鲁超等.原 代 小 鼠 肝 脏 细 胞 的 高 效 分 离 纯 化 与 培 养J.现 代 生 物 医 学 进展,2014,14(06):1005-1008.