ICS 67.050 X 04 备案号：35743-2013 DB 吉林省 地方标准 DB 22/T 1609 2012 动物尿液中-受体激动剂测定 酶联免疫法 Determination of-Agonists in animal urine Enzyme linkde immunosorbent assay 2012-12-01发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1609 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、珲春出入境检验检疫局、白城出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡婷婷、李玲、张琦、杨帆、张勋、杨璐、冯博。DB22/T 1609 2012 1 动物尿液中-受体激动剂测定 酶联免疫法 1 范围 本标准规定了动物尿液中-受体激动剂残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于动物尿液中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗、马布特罗、马喷特罗、特布他林及卡布 特罗残留定性的快速筛 查。2 规范性引用文件 下列文件对 于本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用于本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本 文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法。3 原理 检测的 基础是抗原抗 体 反应，微孔板包被有针对 沙丁胺醇 抗 体的 捕获抗 体。加 入沙丁胺醇 抗 体 后，会与捕获抗 体 结合。经过孵育 及 洗板步骤后，加 入标准 品、样品溶 液及沙丁胺醇酶标 记 物（酶 连接 物），样品 中的-受体激动剂 与 沙丁胺醇酶 连接 物 竞争 沙丁胺醇 抗 体的 连接 位 点（竞争 性酶联免疫法）没有连 接 的沙丁胺醇酶 连接 物 在洗涤步骤 中 被除去。将底 物/发色 剂 加 入 到孔 中并 且孵育。结合 的酶 连接 物 将发色 剂 转化为蓝色 的 产 物。加 入 反应终止 液 后使颜色 由 蓝色转变为黄色。在 450 nm处 测量，吸 光度值 与 样品 中的-受体激动剂 浓度成 反 比。几种待 测物 交叉 反应 率 应不 低 于 50%。4 试剂和材料 除 另 有 说明外，所 用 试 剂 均 为分析 纯，水为 GB/T 6682规定的 一级 水。4.1 氢氧 化 钠（NaOH）。4.2 甲 醇（CH3OH）：色 谱纯。4.3 正己烷（C6H14）：色 谱纯。4.4 盐酸（HCl）。4.5-受体激动剂检测 试 剂 盒：应在有 效 期 内 使 用，保存 于 2-8。不 同批次 的 试 剂 盒 不可 混 用。4.5.1-受体激动剂 系 列 标准 溶 液：浓度依 试 剂 盒 要 求确 定。4.5.2 酶标 板。DB22/T 1609 2012 2 4.5.3 抗 体。4.5.4 酶标 记 物。4.5.5 底 物/发色 剂。4.5.6 反应终止 液。4.5.7 样品 稀释缓冲 液。4.5.8 洗涤 缓冲 液。5 仪器与设备 5.1 酶标 仪：配备 450 nm滤光片。5.2 微 量 加 液 器：单 道 20 L-200 L，200 L-1000 L微 量 加 液 器，多道 50 L-250 L微 量 加 液 器。5.3 振荡器。5.4 涡旋振荡器。5.5 天平：感 量 为 0.01 g。5.6 高 速 离 心 机。6 分析步骤 6.1 试样处理 取 20 L尿液 样品 直 接 进行 检测，如果 尿液 混浊，试 验 前先进行离 心 或 过 滤。6.2 测定步骤 6.2.1 制备 酶标 记 物和 抗 体 使 用液：1：10稀释 酶标 记 物和 抗 体，如取 200 L酶标 记 物及 2 mL样品稀释缓冲 液（4.5.7）稀释 并 混 合 均匀。6.2.2 依次向 微孔 中 加 入 稀释 后 的酶标 记 物 10 L，室 温 下孵育 15 min。6.2.3 倒 出 孔 中液体，每 孔加 入 洗涤 缓冲 液（4.5.8）250 L，弃 去孔 中液体，再 将 酶联 板 倒置 在 滤纸上拍打，重复 洗板 3次。6.2.4 加 入标准 溶 液 或 试样溶 液 20 L，然 后加 入 100 L稀释 后 的酶标 记 物（6.2.1），用 手轻摇 微孔板 混 合，在室 温（20-25）孵育 30 min。6.2.5 弃 去孔 中液体，将 酶联 板 倒置 在吸水 纸上拍打，使孔 内 没有 残 余 液体。每 孔加 入 洗涤 缓冲 液（4.5.8）250 L，弃 去孔 中液体，再 将 酶联 板 倒置 在吸水 纸上拍打，重复 洗板 3次。6.2.6 加 入 100 L底 物/发色 剂（4.5.5）到 各 微孔 中，用 手轻轻摇 动 微孔板 混 合，在室 温（20-25）下 暗 处孵育 15 min。6.2.7 加 入 100 L反应终止 液（4.5.6），在 450 nm处 测定 吸 光度值。DB22/T 1609 2012 3 7 结果计算和表述 7.1 计算相对吸光度值 分 别计算 标准和 样品 的 平均 吸 光值。按 式（1）计算 标准液和 样 液的 相 对吸 光度值。%1000=BBX（1）式 中：X 相 对吸 光度值；B 标准液 或 样 液的 平均 吸 光度值；B0 0 g/L标准液的 平均 吸 光度值。7.2 绘制标准曲线 以相 对吸 光度值 为 纵坐 标，标准 浓度 的 对 数 值（log 10）为 横坐 标 绘 制 标准 曲线。每次 试 验 均 需 重 新 绘 制 标准 曲线。7.3 样品结果计算 通 过 标准 曲线 可 以计算 出 样品 的 浓度值；样品 的-受体激动剂残留物的 总 量按 式（2）计算：n C X=（2）式 中：X 样品 待 测 组 分 的量，单位 为微 克 每 千 克（g/kg）；C 样品 待 测 组 分 的 浓度；n 稀释 倍数。8 结果处理 阳 性 样品 须 用液 相 色 谱 质 谱/质 谱 法（HPLC-MS/MS）确 证。9 筛查浓度范围 本方法的-受体激动剂残留量的筛 查 范围 为 0.3 g/kg 16.2 g/kg。_