ICS 65.020.20 CCS B 61 34 安徽省地方标准 DB34/T 4625 2023 石榴脱毒 苗木繁育 技术规程 Technical regulations for virus-eliminated tissue culture seedling propagation of pomegranate 2023-10-07 发布 2023-11-07 实施 安徽省市 场监督 管 理局 发 布 DB34/T 4625 2023 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1-2020 标 准化 工作导 则 第1 部 分：标准 化文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由安 徽中 以农 业科 技有限 公司 提出。本文件 由安 徽省 林业 局归 口。本文件 起草 单位：安徽 中以 农业科 技有 限公 司、安 徽科 技学院、安徽 省中 以智 农众 创空间 有限 公 司、安徽省 红玛 瑙石 榴科 技有 限公司、安 徽省 质量 和标 准化研 究院。本文件 主要 起草 人：钱 晶 晶、葛伟 强、马 纪忠、洪 少民、胡 能兵、杨友 婷、崔广荣、姚登 波、洪登华、王 宁、吕群 龙、杨小 元、韩 啸。DB34/T 4625 2023 1 石 榴脱毒 苗木繁育 技术规 程 1 范围 本文件 规定 了石 榴脱 毒苗 木组培 生产 过程 的术 语和 定义、环 境要 求、组 培技 术、病 毒检 测和 质量 要求。本文件 适用 于果 用、观赏 石榴品 种的 脱毒 苗木 繁育。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 6000 主要 造林 树种 苗 木质量 分级 GB/T 8321（所 有部 分）农药合 理使 用准 则 LY/T 1893 石 榴苗 木培 育 技术规 程 DB34/T 3410 石榴 生产 技 术规程 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 外植体 explants 植物组 织培 养中 作为 离体 培养材 料的 器官 或组 织的 片段。3.2 石榴组 培 tissue culture of pomegranates 利用石 榴茎 尖等 组织 作为 外植体，在 无菌 条件 下通 过人工 培育 出完 整植 株的 过程。3.3 茎尖脱 毒 virus-eliminated of plant shoot tip 采用茎 尖接 种的 离体 培养 方式，达到 脱除 植物 病毒 的目的。3.4 褐化 browning 培养材 料向 培养 基中 释放 褐色物 质，致使 培养 基逐 渐变成 褐色，影 响培 养物 的生长、分 化，甚 至 死亡的现 象。4 环境要 求 操作间 要求 由准 备室、缓 冲室、接种 室、培 养室、炼苗室 和移 栽温 室等 部分 组成。其中 接种 室、培养室需 要严 格无 菌，所处 环境要 求具 备可 以自 动杀 菌、控 温、控光 等条 件。DB34/T 4625 2023 2 准备室 4.1 用于药 品和 培养 基配 置、器具洗 涤及 灭菌 等，面积 15 m2，温度 为 20 28。缓冲室 4.2 用于室 外与 接种 室或 培养 室 的隔 离缓 冲区 间，应具 备换衣 区、风淋 区，面积 2 m2。接种室 4.3 单间接 种室 面积 10 m2，高度3 m；接种 室要 求严 格无菌，应 具备 超净 工作 台，室 内应 吊装 紫 外线灭菌 灯，距离 地面 1 m 处，其 辐射 强度 应70 W cm-2；2 d 3 d 进行 1 次紫外 消杀 灭菌，1 月2月进行 1 次甲 醛熏 蒸消 杀 灭菌处 理；室内 温度 21 26，相 对湿 度 50%70%。培养室 4.4 用于组培 苗的培养，面积50 m2，方 便隔离和消杀；培养室 要求严格无菌，应具备培 养架，室内应吊装 紫外 线灭 菌灯，距 离地面 1 m 处，其辐 射强 度应70 W cm-2；1 月2 月进 行 1 次甲 醛熏 蒸消杀灭 菌处 理；培养 室环 境相对 湿度 70%80%；光 培养 16 h，22 26，光照强 度 2000 Lux 5000 Lux；暗培 养 8 h，22 26。炼苗室 4.5 应具有 自动 喷雾 或加 湿设 施，温度 22 28、相 对湿 度 50%70%、光 照 1000 Lux 5000 Lux。移栽温 室 4.6 应具有 遮光设 施，遮阳率 25%50%、温度 15 25、相 对湿度 50%70%、自然光 照，光 照过于强烈 时采 取遮 光措 施。5 组培技 术 技术路 线 5.1 组培技 术路 线：外植 体选 取茎 尖接 种 扩繁 培养 生根 培养 病 毒检 测 炼苗 移栽。组培流 程 5.2 5.2.1 外植体 选取 选取无 病虫 害、长势 健壮 的品种 作为 取样 母株，截 取健康、幼 嫩、无病 虫害 的新梢，放 置于 室 内 水培 5 d 7 d。5.2.2 培养基 配置 培养基 采用WPM 为基 本培 养 基，以6-BA、IBA 为 常用 激 素，活 性炭 作为 去除 褐化 常用吸 附剂，不 同生长过程 培养 基配 方如 下：a)茎尖接 种培 养基：WPM+0.4 mg L-1 0.8 mg L-1 6-BA+6.0 g L-1琼脂+25.0 g L-1蔗糖+0.6 g L-1活 性炭；DB34/T 4625 2023 3 b)扩繁培 养基：WPM+0.4 mg L-1 0.6 mg L-1 6-BA+6.0 g L-1琼脂+25.0 gL-1蔗糖+0.2 g L-1活性炭；c)生根培 养基：WPM+0.5 mg L-1 IBA+6.0 g L-1琼脂+25.0 g L-1蔗 糖。5.2.3 接种 剪取茎 尖顶 端 1.0 cm 2.0 cm 作 为接 种外 植体，采 用 0.10%HgCl2 和 无菌 水对 外植体 灭菌，在 接种室无 菌环 境下，通过 解 剖镜剥 取长 度为 0.10 mm 0.15 mm 的茎 尖生 长点，接种于 培养 基中，培养 30 d40 d。5.2.4 扩繁 用组培 苗作 为外 植体，切 去增生 愈伤 后，接种 于扩 繁培养 基中，培 养 25 d 35 d。5.2.5 生根 剪取扩 繁苗 1.0 cm 1.5 cm 的不 定芽 茎段 作为 外植 体，接 种于 生根 培养 基中，插入深 度 0.25 cm 0.35 cm，培养 30 d 40 d。5.2.6 炼苗 选取根 长 0.6 cm 0.8 cm、带 有毛 状根 的组 培苗，置 于炼苗 室，打 开组 培瓶 盖，在光照 1000 Lux 2000 Lux 条件 下炼 苗 1 d 2 d 后，在光 照 3000 Lux 5000 Lux 条件 下炼 苗 2 d3 d。5.2.7 移栽 选取炼 苗后 长势 健壮 组培 苗作为 移栽 苗，用 清水 洗 净根部 培养 基，移 栽至 32 孔标 准配 制基 质（草炭：蛭石：珍珠 岩=3：1：1）穴盘 内。移 栽要 求：温 度 22 28，相对 湿度 30%50%，自然 光照 条件。5.2.8 田间管 理 按 照 GB/T 8321（所 有部 分）和 LY/T 1893 的规定执行。5.2.9 苗木出 圃 按照 DB34/T 3410 的规定 执行。6 病毒检 测 石榴苗 木病 毒主 要检 测对 象 6.1 如下：石榴花 叶病 毒（PoMv,Pomegranate mosaic virus）；李坏死 环斑 病毒 石榴 花叶 株系（PNRSV,Prunus necrotic ringspot virus,pomegranate mosaic strain）。样本抽 样 6.2 6.2.1 移栽苗 木抽 样 DB34/T 4625 2023 4 采 用 随机 取 样法，抽取 移栽 苗 木进 行 病毒 检 测。以1千 株 为基 数（1 千株 的，以1 千 株计 算），1万株内（含 1 万 株），每 增加1 千株 增检 10 株，1 万株，每 增加 1 千 株增 检 2 株。抽 样检 测时 间为移栽 成活 后 3 月 6 月 内。6.2.2 出圃苗 木抽 样 采用随 机取 样法，抽取 出 圃苗木 进行 病毒 检测。以 1 万株 为基 数（1 万 株 的，以 1 万 株计 算），10 万 株内（含 10 万株），每增 加 1 万 株增 检 5 株，10 万株，每 增加 1 万株 增检 2 株。检测方 法 6.3 推荐使 用反转 录 聚合 酶链式 反应检 测法（RT-PCR），选 用试剂 盒进 行RNA 提取及RT-PCR 检测。推荐引 物见 表1。表1 推荐 RT-PCR 法 检测 病毒 对 象及引 物序 列 检测病毒名称 推荐引物序列 石榴花叶病毒（PoMv）3-GCATAGTGCTTCCGTTCAC 5-TGCAGAATTACTGCCCATAGAAAC 李坏死环斑病毒石榴花叶株系（PNRSV）3-CTGTACCACACTGAAAATATATGTTATCAAG 5-CTTGATAACATATTTTCAGTGTCCATACAG 样品保 存 6.4 抽取样 品后，要 求抽 取样 品一式 两份，一 份用 于检 测，一 份由 密封 袋标 记好 时间、地点、样 品 名 称后，放 置于-80 冰箱 中 冻存备 份。病毒检 测要 求 6.5 6.5.1 移栽苗 移栽苗 木检 测，其带 有检 测对象 的病 毒株 允许 率0.1%。6.5.2 出圃苗 出圃苗 木检 测，其带 有检 测对象 的病 毒株 允许 率0.3%。7 质量要 求 抽样要 求 7.1 按照 GB 6000 的规定 执行。检验规 则 7.2 按照 GB 6000 的规定 执行。苗木质 量要 求 7.3 7.3.1 合格苗 木以综 合控 制条件、根 幅、地径 和苗 高确定，达不 到要求 的为 不合格 苗木，合格苗 木 质DB34/T 4625 2023 5 量要求 见 表2。7.3.2 综合控 制条件 为：无检疫 对象病 虫害、苗干 通直、色泽正 常、充 分木 质化、无机械 损伤、健壮苗木。表2 合格苗 木质 量要 求 苗龄（以炼苗成活后移栽为准）地径（cm）苗高（cm）根幅（cm）1 1.0 30.0 25.0 2 1.8 35.0 30.0