ICS 11.220 CCS B.41 45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB45/T 2732 2023 猪链球菌2 型抗体的检测 酶联免疫 吸附法 Detection of streptococcus suis type 2 antibody by enzyme-linked immunosorbent assay 2023-08-10 发布 2023-09-30 实施 广西壮族 自治区 市 场监督管 理局 发 布 DB45/T 2732 2023 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由广 西壮 族自 治区 农业农 村厅 提出 并宣 贯。本文件 由广 西畜 牧业 标准 化技术 委员 会归 口。本文件 起草 单位：广 西壮 族自治 区动 物疫 病预 防控 制中心，广 西学 刊联 信息 科技有 限公 司。本文件 主要起 草人：韦显 凯、郑 敏、闭 璟珊、周庆 安、刘 捷、邹 联斌、苏姣 秀、施 开创、尹彦 文、谢守玉、冯 淑萍、屈 素洁、龙凤、陆 文俊、陈 芳芳、张灿 星、李军。DB45/T 2732 2023 1 猪 链球 菌 2 型抗体 的检测 酶联免 疫吸附 法 1 范围 本文件 规定了 猪链 球菌2 型 抗体的 酶联免 疫吸 附法检 测的原 理、试 剂、器材、试验样 品准备、操 作方法、注意 事项 等要 求。本 文 件 适用 于 广 西 壮族 自治 区 行 政区 域内 猪 链球 菌2 型 抗 体 的检 测和 猪 只接 种猪 链 球 菌2 型 疫苗 后的免疫 效果 评价。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求。3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 酶联免 疫吸 附试 验 enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA，是一 种酶联 免 疫技术。将已 知的 抗原或 抗体吸 附在固 相载 体，加 入待测 的标本，通过底物的 颜色 反应 来判 定有 无相应 的免 疫反 应，颜色 反应的 深浅 与标 本中 相应 抗体或 抗原 的量 呈 正 比，从而测定 抗体 或抗 原含 量。3.2 光密度 optical density 简称OD，测 量被 检测 物吸 收掉的 光以 及有 多少 光穿 过了这 个物 体。4 原理 在 固相 载体 微孔 板上 预包 被纯化 的猪 链球 菌2 型特 异 性抗原，当 被检 血清 中含 有 猪链球 菌2 型抗 体时，抗体与 微孔壁 上的 抗原形 成抗原-抗体 复合物，再 与 羊（兔）抗猪 免疫 球蛋白G（IgG）酶标 记物 反应，最后通 过测 定酶 作用 底物 催化后 的产 物颜 色反 应判 断结果，检 测猪 链球 菌2 型 抗体水 平。5 试剂 使用的 试剂 如下：预包被 猪链 球 菌 2 型 抗原 的微孔 板；血清稀 释液；猪链球 菌2 型阳 性对 照血 清；DB45/T 2732 2023 2 猪链球 菌2 型阴 性对 照血 清；羊（兔）抗 猪免 疫球 蛋 白G（IgG）酶（HRP）标记 二 抗；样品稀 释液，配 制方 法见 附录 A 中的 A.2；10 浓 缩洗 涤液，配 制方 法见附 录 A 中的 A.3；显色 液A，配制 方法 见附 录 A 中的 A.4；显色 液B，配制 方法 见附 录 A 中的 A.5；终止液，配 制方 法见 附 录A 中的A.6；商品化 试剂 盒：可选 择同 类的商 品化 试剂 盒，如猪 链球 菌 2 型 抗体 检测 试剂 盒。6 器材 使用的 器材 如下：微量移 液器，量 程 10 L、100 L、200 L、1000 L；多道可 调移 液器，量 程 30 L300 L；一次性 移液 器吸 头；振荡器；酶标仪，含450 nm 波长 滤 光片；37 恒 温培养 箱或 水浴 箱；容量 为100 mL、1000 mL 的 量筒；离心机；封板膜；一次性 乳胶 手套、口 罩，护目镜；吸水纸 巾；一次性 采血 器，最大 量 程5 mL 或10 mL。7 试验样 品准 备 血液样 品采 集与 处理 7.1 采血方 式为 前腔 静脉 或耳 静脉无 菌采 血。将生 猪保 定好后，用 碘酊 消毒 采血 部位，再 用 75 酒精棉球二 次消 毒，最后 用脱 脂棉球 拭干，使 用 5 mL 或 10 mL 一次性采血 器采 集不少 于 2 mL 的非抗 凝 性全血。室温 下倾 斜静 置 2 h，待血 清自 然析 出后，放 置于 2 8 条件 下不 少 于 2 h，4000 r/min 离心 10 min，使用 1000 L 量程 的移液 器小 心吸 出上 层血 清。血清样 品保 存与 运输 7.2 血清 样品 若在分离后一周内完成检 测，可置于2 8 条件下短期保存；若超过一 周后检测，应置于20 及 以下 条件冷 冻保存。血 清样 品运 输时，按照GB 19489 的要求 进行 样品的 生物 安全 标识，应用恒温 箱加 冰袋 或干 冰密 封等方 式冷 藏运 输，运输 时间应 尽量 缩短，确 保血 清样品 有效。8 操作方 法 试剂配 制 8.1 将10 浓缩 洗涤 液恢 复至 室温，摇匀，然 后用 蒸馏 水或去 离子 水进 行1:10 稀 释，将pH调 节至7.4。DB45/T 2732 2023 3 样品稀 释 8.2 将已分 离好 的待 检猪 血清 样品用 样品 稀释 液进 行1:10 稀释，即 取50 L 样品 加 到450 L 样品 稀释 液中，并 充分 混匀。操作步 骤 8.3 8.3.1 酶标板 上阴 性对 照、阳性 对照和 待检 样品 的分 布参 见表 1。在 A1、B1 加入 阳 性对照，每 孔 100 L；C1、D1 加入 阴性 对照，每孔 100 L；E1、F1 加 入 空白对 照，每 孔 100 L；G1、H1 等 其余 孔加 入稀释好的 待检 样品，每 孔 100 L。表1 加样记 录表 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A P S3 B P S4 C N S5 D N S6 E B S7 F B S8 G S1 S9 H S2 S10 注1：P：阳性对照孔。注2：N：阴性对照孔。注3：B：空白对照孔。注4：S1 S12：待检样品孔，其余类 推。8.3.2 用封板 膜覆 盖板 条，置 于37 恒温 箱或 水浴 箱中孵 育 2 h。8.3.3 弃净孔 中液 体，用力 拍干，每孔 加入 稀释 好的 洗涤 液 300 L，静置1 min 后 弃净、拍干，如 此反复洗 板3 次。8.3.4 除空白 对照 外，其余 每孔 加入酶 标记 物 50 L，置于 37 恒 温箱 或水 浴箱 中 孵育 1 h。8.3.5 按8.3.3 重 复操 作。8.3.6 每孔各 加入 显色 液 A、B 50 L，置 37 避光 环境 条 件中显 色 10 min。8.3.7 每孔加 入终 止液 50 L，混匀后 避光 作用 10 min，终止反 应后 20 min 之 内，用酶标 仪在 450 nm波长下 测 定OD 值。8.3.8 计算S/P 值。S/P(A NC)/(PC NC)(1)式中：S 样本 的吸 光度 值；P 阳性 对照 的吸 光度 值；A 被检 血清OD450 nm 值；NC 阴性 对照OD450 nm 值；PC 阳性 对照OD450 nm 值。DB45/T 2732 2023 4 试验成 立判 定 8.4 阳性对 照OD450 nm 值0.6，且阴性 对照OD450 nm 值 0.3，试验 成立；否 则，试验 不成立，需 重新 试验。结果判 定 8.5 8.5.1 如样 品S/P 值0.60 时，判为猪 链球 菌2 型抗 体阳 性。8.5.2 如样 品S/P 值0.60 时，判为猪 链球 菌2 型抗 体阴 性。8.5.3 若采用 商品 化试 剂盒，应 根据说 明书 进行 操作 及结 果判定。9 注意事 项 所有操 作应 严格 遵守 实验 室生物 安全 相关 规定。9.1 用于加 样的 移液 器应 定期 进行校 准。9.2 10浓 缩洗 涤液 在低 温保 存时可 能会 产生 白色 结晶，应加 热使 其溶 解后 再使 用。9.3 酶标记 物溶液 和终 止液对 呼吸道、眼睛 及皮 肤有刺 激作用，使用 过程 中应戴 口罩、护目镜、手 套 9.4 等防护 用具，不 应直 接接 触和吸 入。酶标记 物溶 液应 避光 保存，避免 与氧 化剂 接触，盛 装底物 溶液 的容 器应 保持 洁净。9.5 所有试 剂均 应按 照相 关要 求进行 保存，使 用前 恢复 至室温。9.6 血清稀 释板 的微 孔只 能使 用一次。同 步进 行多 板检 测时，反应 板不 宜叠 放在 37 温 箱中，宜 将 反 9.7 应板平 放于 湿盒 内或 覆盖 封板膜 后直 接平 放于 温箱 中，不 宜采 用密 封袋。DB45/T 2732 2023 5 A A 附录A（资料 性）溶液的 配制 A.1 磷酸盐 缓冲 液 取氯化 钠8.0 g，磷 酸二 氢 钾0.2 g，磷 酸氢二 钠2.9 g，氯化 钾0.2 g，加蒸 馏水 溶解，调节溶 液pH 至8.0 后 用蒸 馏水 定容 至1000 mL。室 温保 存。A.2 样品稀 释液 取甘油40.0 mL，酪 蛋白20.0 g，硫柳 汞 钠0.1 g，吐温-20 1.0 mL，加入956 mL 磷 酸 盐 缓冲 液 使其 溶解。室 温保 存。A.3 10 浓 缩洗 涤液 取氯化 钠8.0 g，磷 酸二氢 钾0.2 g，磷酸 氢二 钠2.9 g，氯化 钾0.2 g，吐 温-20 5.0 mL，硫柳 汞0.1 g，加80 mL 蒸 馏水 溶解，用1 mol/L 盐 酸调 节溶 液pH 至7.4 后用蒸 馏水 定容 至100 mL。室温保 存。A.4 显色 液A 取四甲 基联 苯胺0.2 g，二 甲基亚 砜8.0 mL，加 蒸馏 水 溶解并 定容 至1000 mL。室 温保存。A.5 显色 液B 取磷酸 氢二 钠14.60 g，柠 檬酸9.33 g，0.75 过 氧化 氢尿素6.4 mL，加800 mL 蒸 馏水溶 解，用1 mol/L盐酸调 节溶 液pH 至5.0 后 用 蒸馏水 定容 至1000 mL。室 温保存。A.6 终止液 将27.8 mL 浓硫 酸缓 慢滴加 入300 mL蒸 馏水 中，边加 边 搅拌，补充 蒸馏 水至1000 mL。