ICS 65.020.30 CCS B 40 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 3401 2024 奶绵羊胚 胎冷冻解 冻技术 规程 Code of practice for freezing and thawing of dairy sheep embryo 2024-04-15 发布 2024-05-15 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 3401 2024 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 归口 单位：内 蒙古 自治区 畜牧 业标 准化 技术 委员会（SAM/TC 19）归 口。本文件 起草 单位：内 蒙古 大学、内蒙 古乌 兰察 布市 畜牧工 作站、蒙 天然 牧业 科技发 展有 限公 司、内蒙古丰 东知 盈牧 业科 技有 限公司。本文件 主要 起草 人：苏小 虎、张 立、李光 鹏、郑重、张立 果、苏广 华、杨磊、白春 玲、赵跃 芳、宋丽爽、张功、刘 信、刘建 宁、刘 权、张惠 文、萨仁 格勒。DB15/T 3401 2024 1 奶绵羊胚 胎冷冻 解冻技术 规程 1 范围 本文件 规定 了奶 绵羊 体内 胚胎形 态鉴 定与 程序 化冷 冻及解 冻技 术要 点。本文件 适用 于奶 绵羊 的体 内胚胎 程序 化冷 冻保 存及 解冻。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。NY/T 1571 羊 胚胎 移植 技 术规程 NY/T 1674 牛 羊胚 胎质 量 检测技 术规 程 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。奶绵羊 dairy sheep 以产奶 为主 要生 产方 向的 绵羊品 种。胚胎冷 冻 embryo freezing 将胚胎 和冷 冻液 装入 冷冻 管中，经过 一定 的降 温方 式将胚 胎保 存于 液氮 中，使其代 谢和 发育 处于 暂时停滞 状态，解 冻后 仍能 正常发 育的 一种 保存 方法。植冰 seeding 又称诱 发结 晶，是指 在略 低于溶 液冰 点的 温度 下通 过加入 冰母 或强 行冷 却的 方式诱 导溶 液结 冰。胚胎解 冻 embryo thawing 将处于 冷冻 状态 的胚 胎进 行解冻 处理，以 恢复 胚胎 发育能 力的 过程。4 胚胎形 态鉴 定 DB15/T 3401 2024 2 供体羊 发情 后的5.5 d 6.5 d 体内 生产 的胚 胎按 照NY/T 1571 使用 体式 显微 镜 进行形 态学 鉴定，形态示 意图 见附 录A。5 胚胎冷 冻保 存 胚胎冷 冻所 需器 材 体视显 微镜、程 序化 冷冻 仪、液 氮罐、捡 胚管、0.25 mL 冷冻 细管、装 管器、玻璃细 管、0.22 m细菌滤 器、胚胎 培养 皿、记号笔、低 温标 签纸。胚胎冷 冻所 需溶 液 保存液：含0.4%（w/v）牛 血清白 蛋白 的PBS液。冷冻液：含1.5 mol/L 乙二醇 的保 存液。冷冻液：含10%（v/v）甘油的 保存 液。冷冻液：含6%（v/v）甘 油的保 存液。冷冻液：含3%（v/v）甘 油的保 存液。胚胎操 作室 要求 温度在20 25 之 间，操作 前使 用紫 外灯 消毒20 min 30 min，胚 胎操 作 区域用75%酒精 擦拭消毒。胚胎选 择 根据形 态选 择发 育期 为早 期桑椹 胚（EM）、紧 缩桑 椹胚（CM）、早 期囊 胚（EB）、囊胚（BL）和 扩张囊胚 期（EXB）的A（1）、B（2）级 胚胎（附 录A 图A.2、A.3）进行 冷冻。胚胎的 洗涤 与平 衡 5.5.1 方法一 乙 二醇 冷冻 液冷 冻胚胎 的洗 涤与 平衡 胚胎冷 冻前 用保 存液 洗涤5 次6 次；洗涤 后的 胚胎 放 入冷冻 液 中，室温 下平 衡15 min 20 min。5.5.2 方法二 甘 油冷 冻液 一步 法胚胎 冷冻 的洗 涤与 平衡 胚胎冷 冻前 用保 存液 洗涤5 次6 次；洗涤 后的 胚胎 放 入冷冻 液 中，室温 下平 衡15 min 20 min。5.5.3 方法三 甘 油冷 冻液 三步 法胚胎 冷冻 的洗 涤与 平衡 胚胎冷 冻前 用保 存液 洗涤5 次6 次；洗 涤后 的胚 胎依 次放入 冷冻 液、和 中，每种 冷冻 液中 室温下平 衡4 min 5 min。胚胎装 管 装管方 法见 附录B，每支 装1枚10 枚 相同 发育 期、相 同级别 胚胎。胚胎记 录 在标签 纸上 打印 记录 胚胎 信息，包括 胚胎 的母 本品 种、母 本耳 号、父 本品 种、父本 耳号、数量、发育期、质量 以及 冷冻 日期，粘贴 于细 管上。数 量、发 育期、质量 标注 方式 为X EM/CM/EB/BL/EXB1/2，其中DB15/T 3401 2024 3 X表示数 量，EM/CM/EB/BL/EXB 表示 发育 期，下标1/2 表示A/B 级胚 胎级 别。如2 CM1 代表2枚A 级紧 缩桑 椹胚，2 CM2 代表2 枚B 级紧 缩 桑椹胚。冷冻程 序 5.8.1 方法一 乙 二醇 冷冻 液冷 冻胚胎 程序 胚胎冷 冻细 管由 室温 直接 置入-6.0 的 程序 化冷 冻 仪中，平衡4 min5 min 后，在-6.0 时植冰1 s 3 s，继续 平衡5 min，然 后以-0.3-0.5/min 的速 率降 温至-35，平 衡10 min，取 出胚胎冷冻 细管，迅 速投 入液 氮罐中 保存。同 时详 细记 录胚胎 信息，胚 胎冷 冻信 息登记 表见 附录C表C.1。5.8.2 方法二 甘 油冷 冻液 冷冻 胚胎程 序 胚胎冷 冻细 管由 室温 直接 置入-6.5 的 程序 化冷 冻 仪中，平衡4 min 5 min 后，在-6.5 时植冰1 s 3 s，植 冰之 后的 操作步 骤同5.8.1。6 胚胎解 冻 胚胎解 冻所 需器 材 水浴锅、其 余同5.1（体 视 显微镜、液 氮罐、捡 胚管、0.22 m 细菌 滤器、胚 胎培养 皿）。胚胎解 冻所 需溶 液 保存液 配方 同5.2。解冻液：含0.25 mol/L 蔗糖的 保存 液。解冻液：含1 mol/L 蔗 糖 的保存 液。解冻液：含0.3 mol/L 蔗糖+3%（v/v）甘 油的 保存 液。解冻液：含0.3 mol/L 蔗糖+6%（v/v）甘 油的 保存 液。胚胎操 作室 要求 胚胎操 作室 要求 同5.3。解冻程 序 6.4.1 方法一 一 步法 解冻 程序 解冻时，从液 氮罐 中取 出 细管在 空气 中停 留10 s 15 s 后，浸入28 32 水浴中20 s，然后 将胚胎冷 冻细 管用 灭菌 吸水 纸擦干，用75%酒精 棉球 擦 拭细管，晾 干15 s 20 s，剪去 封口 端，把胚 胎推出，乙 二醇 冷冻 液冷 冻胚 胎置入 解冻 液 中、甘油 冷冻液 冷冻 胚胎 置入 解冻 液 中 平衡4 min 5 min，然后在 保存 液中 洗5 次 6 次，镜检 备用。同时 在记 录 本上详 细记 录胚 胎信 息，解冻胚 胎信 息登 记表 见附录C表C.2。6.4.2 方法二 三 步法 解冻 程序 解冻时，从液 氮罐 中取 出 细管在 空气 中停 留10 s 15 s 后，浸入25 32 水浴中20 s，然后 将胚胎冷 冻细 管用 灭 菌 吸水 纸擦干，用75%酒精 棉球 擦 拭细管，晾 干15 s 20 s，剪去 封口 端，把胚 胎推出后，依次 置入 解冻 液、和 中 平衡4 min 5 min，然 后在 保存 液中 洗5 次6 次，镜 检备 用。同 时在记录 本上 详细 记录 胚胎 信息，解冻 胚胎 信息 登记 表按照 附录C中 的表C.2。DB15/T 3401 2024 4 解冻后 胚胎 形态 鉴定 按NY/T 1674 执 行。解冻 后 胚胎形 态等 级信 息登 记表 见附录C表C.2。DB15/T 3401 2024 5 A A 附录A（资料 性）不同发 育时 期及 不同 级别 胚胎形 态图 A.1 不同发 育时 期早 期胚 胎见 图 A.1。注：a：桑椹胚（morula，M）；b：紧缩桑椹胚（compacted morula，CM）；c：早期囊胚（early blastocyst，EB）；d：囊胚（blastocyst，BL）；e：扩张囊胚（expanded blastocyst，EXB）。A.2 A 级胚 胎见 图A.2。注：a：紧缩桑椹胚（compacted morula，CM）；b：早期囊胚（early blastocyst，EB）；c：囊 胚（blastocyst，BL）。A.3 B 级 胚胎见 图 A.3。注：a：桑椹胚（morula，M）；b：紧缩桑椹胚（compacted morula，CM）。A.4 D 级胚 胎见 图A.4。注：a：C 级桑椹胚（morula，M）；b：D 级胚胎（退化胚，不可用）。图A.1 D 级 胚胎 DB15/T 3401 2024 6 B B 附录B（规范 性）胚胎装 管示 意图 胚胎装 管示 意图 见图B.1。注：l1：1.0 cm 1.5 cm；l：1.5 cm 2.0 cm；l3：2.0 cm 3.0 cm；l4：0.2 cm 0.4 cm。图B.1 胚胎 装管 示意 图 DB15/T 3401 2024 7 C C 附录C（规范 性）胚胎冷 冻和 解冻 记录 表 C.1 冷冻胚 胎信 息登 记表 见 表C.1。表C.1 冷冻 胚胎 信息 登记 表 序号 母本 品种 母本耳号 父本 品种 父本 耳号 发育 时期 质量 等级 胚胎 数量 冷冻 时间 存放位置编号 备注 C.2 解冻胚 胎信 息登 记表 见 表C.2。表C.2 解冻 胚胎 信息 登记 表 序号 冷冻胚胎信息 冷冻时间 解冻时间 解冻后质量 移植受体 备注