ICS 65.020.20 CCS B 05 45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB45/T 2755 2023 百香果品 种鉴定技 术规程 SSR 分子标 记法 Code of practice identification of passion fruit varieties by SSR molecular marker method 2023-08-10 发布 2023-09-30 实施 广西壮族 自治区 市 场监督管 理局 发 布 DB45/T 2755 2023 I 目 次.II 1.1 2.1 3.1 4.1 5.2 6.2.2 6.1.2 6.2.2 6.3 7.3 8 SSR.3 9.4.4 9.1 DNA.4 9.2 PCR.4 9.3 PCR.4 9.4 10.5.5 10.1.5 10.2 11.6.6 11.1.6 11.2 A.7 DB45/T 2755 2023 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB45/T 2755 2023 1 百 香果品 种鉴定技 术规程 SSR 分 子标记 法 1 范围 simple sequence repeat SSR SSR SSR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 NY/T 2594 DNA 3 术语和 定义 NY/T 2594 3.1 核心引 物 core primer SSR 3.2 对照品 种 control variety SSR 3.3 聚合酶 链式 反应 polymerase chain reaction DNA 95 60 DNA 72 DNA 5-3 4 缩略语 SSR Simple Sequence Repeat PCR(Polymerase Chain Reaction DB45/T 2755 2023 2 DNA Deoxyribo Nucleic Acid 5 原理 SSR SSR PCR 6 材料和 试剂 一般规 定 6.1 GB/T 6682 PCR 试剂 6.2 6.2.1 C4H11NO3 99.0 6.2.2 EDTA-2Na 99.0 6.2.3 H3BO3=1.43 g/cm 99.5 6.2.4 CTAB=1.32 g/mL 99.0 6.2.5 NaCl=2.165 g/cm 99.5 6.2.6 6.2.7(NH4)2S2O8=1.98 g/cm 98.0 6.2.8(NaOH=2.13 g/cm 96.0 6.2.9 AgNO3=4.35 g/cm 98.0 6.2.10 HCHO=0.815 g/cm 6.2.11 N2=0.81 g/cm 6.2.12 CHCl3=1.50 g/cm 6.2.13 CH3CH2OH=0.79 g/cm 99.7 6.2.14 DNA LIZ 500 6.2.15 CH3NO=1.133 g/mL 6.2.16 40/Acryl/Bis Solution(29:1)6.2.17 TEMED=1.32 g/mL 6.2.18 DNA DNA marker 50 bp 500 bp DNA 6.2.19 2Taq Plus PCR 0.1 U/L Taq Plus Polymerase 500 mol/L dNTP each 20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)100 mmol/L KCl 3 mmol/L MgCl2 溶液配 制 6.3 6.3.1 5TBE 缓 冲液 5.40 g 6.1.1 0.372 g 6.1.2 2.75 g 6.1.3 70 mL 100 mL 103.4 kPa 121 20 min 6.3.2 0.5 TBE 缓冲 液 100 mL 5 TBE 6.2.1 900 mL DB45/T 2755 2023 3 6.3.3 CTAB 提取 溶液 4.00 g 6.1.4 16.38 g 6.1.5 1.21 g 6.1.1 1.49 g 6.1.2 70 mL 200 mL 103.4 kPa 121 20 min 6.3.4 无菌一 级水 103.4 kPa 121 20 min 6.3.5 1琼 脂糖 溶液 1 g 6.1.6 100 mL 0.5 TBE 6.2.2 6.3.6 10过 硫酸 铵溶 液 10 g 6.1.7 100 mL 6.3.7 电泳缓 冲液 108 g 6.1.1 7.44 g 6.1.2 55 g 6.1.30.80 g 6.1.8 10 L 6.3.8 染色液 0.2 g 6.1.9 400 mL 6.3.9 显色液 4.0 g 6.1.8 400 mL 1.6 mL 6.1.10 7 仪器和 设备 1 mg 7.1 7.2 7.3 PCR 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8 SSR 引 物序 列信 息 A DB45/T 2755 2023 4 9 操作步 骤 样品采 集 9.1 5 0 8-18 DNA 提取 9.2 9.1 1 g 2 g 6.1.11 100 mg 1.5 mL 750 CTAB 6.2.3 65 45 min 60 min 15 min 500 6.1.12 12 000 r/min 3 min 0.5 mL 0.5 mL 4 6.1.13-18 1 h 12 000 r/min 3 min 50 6.2.4-18 注：DNA PCR DNA PCR 扩增 9.3 9.3.1 PCR 反 应体 系 PCR 1 表1 PCR 反 应体 系-8.5 2Taq Taq Plus PCR 1 12.5 10/L 0.4 1.0 10 0.4 1.0 25 2.0 2.0-25.0 9.3.2 PCR 反 应程 序 94 5 min 94 30 s 30 s A 72 30 s 35 72 7 min PCR 产 物检 测 9.4 9.4.1 非变性 聚丙 烯酰 胺凝 胶电 泳检测 9.4.1.1 聚丙烯 酰胺 凝胶 制备 1.0 mm 1 6.2.5 50 mL 7.5 mL 5TBE 6.2.1 7.5 mL 40 Acryl/Bis Solution(29:1)6.1.16 30 mL 200 6.2.6 12 6.1.17 50 min 60 min 10 cm DB45/T 2755 2023 5 9.4.1.2 电泳 6.2.7 1 PCR 1 6.1.18 1 V/cm 5 V/cm 6.1.19 1/2 2/3 50 min 70 min 9.4.1.3 银染显 色 a)30 s 60 s b)6.2.8 5 min 10 min c)20 s d)6.2.9 e)f)9.4.2 毛细管 电泳 检测 9.4.2.1 PCR 产 物样 品准 备 PCR 1 DNA 96 0.1 500 6.1.14 8.9 6.1.15 PCR 95 5 min 10 min 15 min 96 4 000 r/min 10 s DNA 9.4.2.2 电泳检 测 10 数据记 录与 统计 数据记 录 10.1 10.1.1 SSR 10.1.2 DNA 10.1.3 统计 10.2 X/X X X/Y X Y 2 0/0 示例1：1 160 bp 160/160 示例2：2 160 bp 165 bp 160/165 DB45/T 2755 2023 6 11 结果判 定 判定方 法 11.1 11.1.1 2 11.1.2=1 11.1.3=0 结果表 述 11.2 DB45/T 2755 2023 7 A A 附录A（规范 性）引物序 列信 息 A.1 表A.1 引物 编号 及引 物扩 增信 息 bp 5-3 1 PeRM10001 95 107 50 GCA TGG ACT TGA TTT GTA TAT TCT GAG AAC AAT GAT GTC ACT TTC ATA 2 PeRM10005 98 140 50 TAG TGA CAT AAC TGA AAA CGC TAT GAG TTA CCG CTG AAG TTT TCT A 3 PeRM10006 149 190 50 TCA TTA ACA TCG TAA ACA AAG ATT AAT TCG ACA AGA TTT ACT GAT ACA 4 PeRM10007 95 106 50 GTA GTA GGA GAA TAT TTG AGG GAA CTA TTT TGT GAT CCA AGG AAG T 5 PeRM10008 105 123 50 GTC ACT ATC ATC CCA TAA AAA TTC AGG TAA AAT TAA TAT GAT AAG CGA A 6 PeRM10009 135 145 50 GAT TGA TTT GTG GAT GGA TAC T CAC TTG TTT CAC TCG TAC AAT AAT 7 PeRM10011 120 130 109 55 ATG GAG AAG ACT TCA GAG TCA C AGA GAT ATT TTT CAC TCA CTG GAT 8 PeRM10012 135 180 151 50 CTC CAT ATC AGA TTA AGT AAC CAC CTC AAA TAA AAA CAA ACC TGT TAC 9 PeRM10014 130 140 50 CAT TTA TAA AGG AAT TGA CAA GAA CTG AGT TAA TGC TGT GAT TAA GAT 10 PeRM10016 149 50 AAT TTT CTT GGC TTA AAA CAC TAC TTG ACT TCA CTG CTA TGG TAT TAG 11 PeRM10017 146 176 50 AAG ACA CTG ATA GTT CTC TGA GG CAA ATT ATG ATA AGA AAC TTG GAA 12 PeRM10018 160 170 50 ACA GAA AAG AAA GAT AAA GCA AAT TTC AGT ATC CAA CTG AAC ACA C 13 PeRM10019 142 150 50 TGG TAG TCA ATC AGA AAA CTA AGA GAG TTG TTA GGT CTC CTC AAC TTA 14 PeRM10020 132 142 50 AAC AGG GTA TAC TGT AAA TCA TTG GTT TAT TCC TTT CTC TTC TAG TGC 15 Pa_F-P10A10 220 50 TGG AAT GTG ATT TGC ATG G TAG GTA TTG CTG GCG AAG 16 Pa_F+R-Contig114 290 50 CTT GCC TCT CTC CCT CTC GGG TTT TGG GTT TGA CAG DB45/T 2755 2023 8 表A.1 引 物编 号及 引物 扩 增信息 bp 5-3 17 Pa_F-Contig13 293 50 CAG AAG GAA AAC CAG CAA G CCC CAT CAT CAT CAC TTT C 18 Pa_F-P7E10 240 255 50 TTA ATG CCA CAG CCC AAC TGA CCC AAA ATC AAA CAC C 19 Pa_F+R-Contig80 360 380 55 TGT TCA AGC CCA TCT TCG GCT CTC GCT CTT GTC GTA G 20 Pa_F-P6H04 280 295 55 GAA TAG GGT CAG CAG GAG G GAG TGT GTC ATC GGA GTC C 21 PE 2 223 53 GAT CGG TCC TCG GTT AGA C AGT CAC ACA GCA TGA GAA ATC 22 PE 6 258 53 GCA ATT TCA CCA TCT TCT GCT CCA CGG TCA TGG ATG TTC 23 PE 10 145 150 55 TTG CTC ATT GCA CTC ATC CT GCA GAC ATT TCC TGG AGC A 24 PE 12 260 290 55 CCA TAG TCC CAA CAA GCA TC GCT GTG GAC CCT AAC TCA GTC 25 PE 13 260 50 TCA GGA AGA TTG CAT GTT AGT CTG GGT TTTG TTT ATG TTG C 26 PE 15 230 270 53 CCG TGA ACC AAC CAT TTC TC TTG CAG CAC AAA CAA GTC AA 27 PE 16 180 270 53 AGG ATC ACC ATA GAA AAC CAT GTT AGG TTG GCA TTG CTC TT 28 PE 18 210 230 50 GTC ACT TCA TTC TTC CTT TCC TTA GCC CAC TCA AAC ACA A 29 PE 27 250 53 CAC ATT TGC CGT CAC TGG CGG CAT ACG ATA AAT CTC CTG 30 PA 8 270 53 TCT AAT GAG CGG AGG AAA GC CCG GAT ACC CAC GCA TTA 31 PA 9 265 320 53 GGG CCT TTA TCC ATG TTT GA GGA AAT CCG AAA ACT GGT TG