ICS 65.020.20 CCS B 05 45 广 西 壮 族 自 治 区 地方标准 DB45/T 2754 2023 芒果品种 鉴定技术 规程 SSR 分子标记法 Code of practice identification of mango varieties by SSR molecular marker method 2023-08-10 发布 2023-09-30 实施 广西壮族 自治区 市 场监督管 理局 发 布 DB45/T 2754 2023 I 目 次.II 1.1 2.1 3.1 4.1 5.2 6.2.2 6.1.2 6.2.2 6.3 7.3 8 SSR.3 9.4.4 9.1 DNA.4 9.2 PCR.4 9.3 PCR.4 9.4 10.5.5 10.1.5 10.2 11.6.6 11.1.6 11.2 A.7 DB45/T 2754 2023 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB45/T 2754 2023 1 芒 果品种 鉴定技术 规程 SSR 分子 标记法 1 范围 simple sequence repeat SSR SSR SSR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 NY/T 2594 DNA 3 术语和 定义 NY/T 2594 3.1 核心引 物 core primer SSR 3.2 对照品 种 control variety SSR 3.3 聚合酶 链 式 反应 polymerase chain reaction DNA 95 60 DNA 72 DNA 5-3 4 缩略语 SSR Simple Sequence Repeat PCR(Polymerase Chain Reaction DNA Deoxyribo Nucleic Acid DB45/T 2754 2023 2 5 原理 SSR SSR PCR 6 材料和 试剂 一般规 定 6.1 GB/T 6682 PCR 试剂 6.2 6.2.1 C4H11NO3 99.0 6.2.2 EDTA-2Na 99.0 6.2.3 H3BO3=1.43 99.5 6.2.4 CTAB=1.32 g/mL 99.0 6.2.5 NaCl=2.165 g/cm 99.5 6.2.6 6.2.7(NH4)2S2O8 8 98.0 6.2.8(NaOH 3 96.0 6.2.9 AgNO3 5 98.0 6.2.10 HCHO 5 6.2.11 N2 1 6.2.12 CHCl3 0 6.2.13 CH3CH2OH 9 99.7 6.2.14 DNA LIZ 500 6.2.15 CH3NO 3 g/mL 6.2.16 40/Acryl/Bis Solution(29:1)6.2.17 TEMED 2 g/mL 6.2.18 DNA DNA marker 50 bp 500 bp DNA 6.2.19 2 Taq Plus PCR 0.1 500 mol/L dNTP each 20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)100 mmol/L KCl 3 mmol/L MgCl2 溶液配 制 6.3 6.3.1 5TBE 缓 冲液 5.4 g 6.1.1 0.372 g 6.1.2 2.75 g 6.1.3 70 mL 100 mL 103.4 kPa 121 20 min 6.3.2 0.5 TBE 缓冲 液 100 mL 5 TBE 6.2.1 900 mL DB45/T 2754 2023 3 6.3.3 CTAB 提取 溶液 4 g 6.1.4 16.38 g 6.1.5 1.21 g 6.1.11.49 g 6.1.2 70 mL 200 mL 103.4 kPa 121 20 min 6.3.4 无菌一 级水 103.4 kPa 121 20 min 6.3.5 1琼 脂糖 溶液 1 g 6.1.6 100 mL 0.5 TBE 6.2.2 6.3.6 10过 硫酸 铵溶 液 10 g 6.1.7 100 mL 6.3.7 电泳缓 冲液 108 g 6.1.1 7.44 g 6.1.2 55 g 6.1.30.8 g 6.1.8 10 L 6.3.8 染色液 0.2 g 6.1.9 400 mL 6.3.9 显色液 4 g 6.1.8 400 mL 1.6 mL 6.1.10 7 仪器和 设备 1 mg 7.1 7.2 7.3 PCR 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8 SSR 引 物序 列信 息 A DB45/T 2754 2023 4 9 操作步 骤 样品采 集 9.1 5 0 8-18 DNA 提取 9.2 9.1 1 g 2 g 6.1.11 100 mg 1.5 mL 750 CTAB 6.2.3 65 45 min 60 min 15 min 500 6.1.12 12 000 r/min 3 min 0.5 mL 0.5 mL 4 6.1.13-18 1 h 12 000 r/min 3 min 50 6.2.4-18 注：DNA PCR DNA PCR 扩增 9.3 9.3.1 PCR 反 应体 系 PCR 1 表1 PCR 反 应体 系-8.5 2 Taq Taq Plus PCR 12.5 10 0.4 1.0 10 0.4 1.0 25 DNA 2.0 2.0-25.0 9.3.2 PCR 反 应程 序 94 5 min 94 30 s 30 s A 72 30 s 35 72 7 min PCR 产 物检 测 9.4 9.4.1 非变性 聚丙 烯酰 胺凝 胶电 泳检测 9.4.1.1 聚丙烯 酰胺 凝胶 制备 1.0 mm 1 6.2.5 50 mL 7.5 mL 5 TBE 6.2.1 7.5 mL 40 Acryl/Bis Solution(29:1)6.1.16 30 mL 200 6.2.6 12 6.1.17 50 min 60 min 10 cm DB45/T 2754 2023 5 9.4.1.2 电泳 6.2.7 1 A PCR 1 6.1.18 1 V/cm 5 V/cm 2 Taq Plus 6.1.19 1/2 2/3 50 min 70 min 9.4.1.3 银染显 色 a)30 s 60 s b)6.2.8 5 min 10 min c)20 s d)6.2.9 e)f)9.4.2 毛细管 电泳 检测 9.4.2.1 PCR 产 物样 品准 备 PCR 1 DNA 96 0.1 DNA LIZ 500 6.1.14 8.9 6.1.15 PCR 95 5 min 10 min 15 min 96 4 000 r/min 10 s DNA 9.4.2.2 电泳检 测 10 数据记 录与 统计 数据记 录 10.1 10.1.1 SSR 10.1.2 DNA 10.1.3 统计 10.2 X/X X X/Y X Y 2 0/0 示例1：1 160 bp 160/160 示例2：2 160 bp 165 bp 160/165 DB45/T 2754 2023 6 11 结果判 定 判定方 法 11.1 11.1.1 2 11.1.2=1 11.1.3=0 结果表 述 11.2 DB45/T 2754 2023 7 A A 附录A（规范 性）引物序 列信 息 A.1 表A.1 引物 编号 及引 物扩 增信 息 bp-1 mangoES11 148 248 55 CTTCCTTTCTCTCATCACTTCCA CTTCAATAGTAGCCCCATCACTG 2 mangoES24 157 270 55 CAGTAACTACTACCACCGCAACC ATATTCTCGCTCTCGTTGTTTTG 3 mangoES35 156 246 55 TCCATTTTTGACAAATCTCCACT TAGCCTTGAATTCCTCAAACAAA 4 mangoES39 143 163 55 GGTTGTTATCGTCGTTATTGTGG CGGAAAATGTTCGACTTGTAACT 5 mangoES40 144 244 55 GGGACATTGACTTAACAGCTTTC CTTCTGCCTGAATGTACTGGACT 6 mangoES69 150 210 55 CCTGTGCTTACCACCCATATTAG AAAGATTGCAAGTCTGAGCAAAA 7 mangoES71 125 180 55 TGATGAGAATGAACAAGCAGCTA TATCTGCAGTAACAGCACTCAGC 8 mangoES126 143 200 55 CGGGTAAACCCACTATGTATTCC TGGTGGTGGTAAAAAGAAGAAAA 9 mangoES170 150 158 55 TCGAGAGCTACTCTTTATCGGAA AATTAAGCGTGCAAACCTGTAGA 10 mangoES172 146 196 55 TATCATCAGAACTACCGCCATTT CTCTTTTCTTCGCTGTGTTTTGT 11 EST14 175 290 50 ATTATCCCTATAATGCCCTAT CTCGGTTAACCTTTGACTAC 12 MCR55 170 220 58 AGGACATCTGTGACCAAGAGC TTCCCACCCACAACTCCAAC 13 MCR130 250 260 58 TGTCTTTCAGCTTCACCGCT CGCAGTGGAGAGTTGTTGTG 14 MCR220 250 510 58 CGGGACCATGTCACCAGAAA GGCGAATGCGTAGTCAGAGA 15 Lmma1 205 255 50 ATGGAGACTAGAATGTACAGAG ATTAAATCTCGTCCACAAGT 16 Lmma4 240 380 47 AGATTTAAAGCTCAAGAAAAA AAAGACTAATGTGTTTCCTTC DB45/T 2754 2023 8 表A.1 引 物编 号及 引物 扩 增信息 2 3 bp-17 Lmma5 280 390 47 AGAATAAGCTGATACTCACAC TAACAAATATCTAATTGACAGG 18 Lmma6 105 205 50 ATATCTCAGGCTTCGAATGA TATTAATTTTCACAGACTATGTTCA 19 Lmma7 210 250 50 ATTTAACTCTTCAACTTTCAAC AGATTTAGTTTTGATTATGGAG 20 Lmma8 260 360 50 CATGGAGTTGTGATACCTAC CAGAGTTAGCCATATAGAGTG 21 Lmma9 205 230 47 TTGCAACTGATAACAAATATAG TTCACATGACAGATATACACTT 22 Lmma10 155 210 50 TTCTTTAGACTAAGAGCACATT AGTTACAGATCTTCTCCAATT 23 Lmma11 240 410 49 ATTATTTACCCTACAGAGTGC GTATTATCGGTAATGTCTTCAT 24 Lmma12 210 250 47 AAAGAATAGCATTTAATTAAGGA GTAAGTATCGCTGTTTGTTATT 25 Lmma13 180 230 47 CACAGCTCAATAAACTCTATG CATTATCCCTAATCTAATCATC 26 Lmma15 220 270 50 AACTACTGTGGCTGACATAT CTGATTAACATAATGACCATCT 27 Lmma16 220 250 50 ATAGATTCATATCTTCTTGCAT TATAAATTATCATCTTCACTGC 28 AY942818 125 150 55 CCACGAATATCAACTGCTGCC TCTGACACTGCTCTTCCACC 29 AY942819 90 140 53 AAACGAGGAAACAGAGCAC CAAGTACCTGCTGCAACTAG 30 AY942820 170 230 53 AGGTCTTTTATCTTCGGCCC AAACGAAAAAGCAGCCCA 31 AY942821 280 410 49 TGTAGTCTCTGTTTGCTTC TTCTGTGTCGTCAAACTC 32 AY942823 230 55 AGAATAAAGGGGACACCAGAC CCATCATCGCCCACTCAG 33 AY942824 220 320 50 TTGATGCAACTTTCTGCC ATGTGATTGTTAGAATGAACTT 34 AY942825 240 390 53 CGAGGAAGAGGAAGATTATGAC CGAATACCATCCAGCAAAATAC 35 AY942826 240 50 TGTGAAATGGAAGGTTGAG ACAGCAATCGTTGCATTC DB45/T 2754 2023 9 表A.1 引 物编 号及 引物 扩 增信息 3 3 bp-36 AY942827 180 240 49 GTTTTCATTCTCAAAATGTGTG CTTTCATGTTCATAGATGCAA 35 AY942826 240 50 TGTGAAATGGAAGGTTGAG ACAGCAATCGTTGCATTC 36 AY942827 180 240 49 GTTTTCATTCTCAAAATGTGTG CTTTCATGTTCATAGATGCAA 37 AY942828 130 290 53 CTCGCATTTCTCGCAGTC TCCCTCCATTTAACCCTCC 38 AY942829 370 500 50 GAACGAGAAATCGGGAAC GCAGCCATTGAATACAGAG