I C S 6 5.0 2 0.2 0B 0 5黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 地 方 标 准DB23D B 2 3 0 8/T 1 8 4 2 0 2 3稻 瘟 病 病 菌 单 孢 分 离 培 养 技 术 操 作 规 范2 0 2 3-1 2-1 1 发 布 2 0 2 4-0 1-1 1 实 施佳 木 斯 市 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 2 3 0 8/T 1 8 4 2 0 2 3I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。请 注 意 本 文 件 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利，本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 农 业 农 村 局 提 出 并 归 口。本 文 件 由 黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 市 场 监 督 管 理 局 批 准 发 布。本 文 件 起 草 单 位：黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 水 稻 研 究 所。本 文 件 主 要 起 草 人：王 桂 玲、陆 文 静、韩 笑、周 雪 松、宋 成 艳。本 文 件 2 0 2 3 年 首 次 发 布。D B 2 3 0 8/T 1 8 4 2 0 2 31稻 瘟 病 病 菌 单 孢 分 离 培 养 技 术 操 作 规 范1 范 围本 文 件 规 定 了 水 稻 稻 瘟 病 菌 分 离 所 使 用 的 仪 器 和 用 具、培 养 基 去 杂 质 方 法 及 单 孢 分 离 培 养 程 序 和 方法 等 技 术 规 范。本 文 件 适 用 于 黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 稻 瘟 病 菌 单 孢 分 离 技 术。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的，凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。D B 2 3 0 8/T 1 2 4-2 0 2 2 稻 瘟 病 菌 生 理 小 种 鉴 定 技 术 规 程。3 术 语 和 定 义3.1 稻 瘟 病由 稻 梨 孢 真 菌 引 起 的 一 种 水 稻 病 害，又 称 稻 热 病、火 烧 瘟、叩 头 瘟。病 菌 侵 染 叶 片、茎 秆、穗 颈、小 穗 梗 和 谷 粒。根 据 受 害 时 期 和 侵 染 部 位 不 同，可 分 别 引 起 苗 瘟、叶 瘟、节 瘟、穗 颈 瘟 和 谷 粒 瘟。3.2 单 孢 分 离 法由 单 个 孢 子 繁 殖 来 获 得 纯 菌 种 的 方 法。4 仪 器 和 用 具4.1 常 用 仪 器4.1.1 超 净 工 作 台洁 净 等 级：1 0 0 级 0.5 u m。平 均 风 速：0.2 5 m/s 0.6 m/s。4.1.2 高 压 灭 菌 锅温 度 范 围：0 1 3 5，灭 菌 时 间 范 围：4 m i n 1 2 0 m i n，最 高 工 作 压 力：0.2 2 M P a 0.2 5 M P a。4.1.3 恒 温 培 养 箱温 度 范 围：0 5 0。温 度 波 动：1。光 照 度：0 L X 7 5 0 0 L X。4.1.4 光 学 显 微 镜D B 2 3 0 8/T 1 8 4 2 0 2 32目 镜：1 0；物 镜：1 0、4 0。4.1.5 电 子 天 平感 量 0.0 1 g。4.2 常 用 用 具剪 刀、无 菌 载 玻 片、试 管、接 种 针、培 养 皿、医 用 白 瓷 盘、滤 纸、移 液 器、医 用 纱 布、酒 精 灯、记号 笔，铗 子。5 分 离 技 术5.1 分 离 方 法悬 挂 震 落 法 分 离 单 孢 菌 株。5.2 培 养 基 的 配 制酵 母 淀 粉 培 养 基（淀 粉 1 0 g、酵 母 粉 2 g、琼 脂 粉 2 0 g、蒸 馏 水 1 0 0 0 m L）、琼 脂 培 养 基（琼 脂粉 1 5 g 2 0 g、蒸 馏 水 1 0 0 0 m L），在 1 2 1 湿 热 灭 菌 2 0 m i n。5.3 培 养 基 去 杂 质琼 脂 质 量 的 高 低 对 单 孢 的 分 离 有 较 大 的 影 响。杂 质 少，培 养 基 透 明 度 高，孢 子 震 落 后 在 显 微 镜 下 易于 镜 检，可 提 高 挑 取 单 孢 效 率，如 果 质 量 较 差，需 采 用 蛋 白 去 杂 的 方 法（每 配 制 1 0 0 0 m L 的 培 养 基，可 用 一 颗 鸡 蛋 的 蛋 清 参 混。方 法 是 将 琼 脂 粉 煮 化 后，冷 却 至 4 0 5 0，加 入 蛋 清，并 迅 速 用 玻 璃 棒搅 动 5 m i n 左 右，使 之 成 泡 沫 状，再 重 新 加 热 煮 沸，以 此 琼 脂 粉 中 的 杂 质 附 着 于 凝 固 的 蛋 白 内，而 后 先用 1 层 2 层 纱 布，将 大 块 蛋 白 滤 除，再 用 7 层 纱 布 过 滤，所 得 滤 液 即 可 装 瓶 灭 菌 备 用。）5.4 病 菌 标 样 消 毒取 新 采 集 的 1 c m 长 的 发 病 组 织（节 瘟 或 穗 颈 瘟）用 7 5%酒 精 消 毒（3 0 s 左 右），然 后 用 无 菌 水冲 洗。5.5 病 菌 标 样 培 养在 干 净 的 培 养 皿 中 放 入 1 张 滤 纸 或 2 层 吸 水 纸，加 入 少 量 无 菌 水（浸 湿 吸 水 纸 即 可），把 冲 洗 消毒 过 的 发 病 标 样 放 在 吸 水 纸 上 盖 好 后，放 在 2 6 光 照 培 养 箱 中 培 养 1 d 2 d，标 样 表 面 就 会 产 生 深灰 色 霉 层（即 孢 子）。5.6 孢 子 震 落按 照 D B 2 3 0 8/T 1 2 4-2 0 2 2 执 行。5.7 单 孢 镜 检镜 检 时 将 培 养 皿 反 转 放 在 显 微 镜 的 载 物 台 上，在 1 0 1 0 倍 的 显 微 镜 下 查 找 稻 瘟 病 菌 孢 子，同 时在 其 附 近 无 其 他 孢 子 和 杂 菌 存 在 时，用 蘸 水 钢 笔 在 单 孢 处 轻 轻 点 一 墨 水 小 圆 点，以 小 圆 点 为 中 心 画 个 小圆 圈，将 点 过 的 小 圆 点 用 洒 精 棉 擦 掉，再 进 一 步 检 查 所 划 圆 圈 内 是 否 是 单 个 孢 子，确 定 无 其 它 孢 子 后，D B 2 3 0 8/T 1 8 4 2 0 2 33再 用 蘸 水 钢 笔 在 单 孢 处 轻 轻 点 一 墨 水 小 圆 点，在 无 菌 条 件 下 将 所 画 圆 圈 内 的 单 孢 挑 入 酵 母 淀 粉 培 养 基上。5.8 单 孢 提 纯将 琼 脂 培 养 基 上 的 稻 瘟 病 菌 单 孢 接 种 到 酵 母 淀 粉 培 养 基 上，在 培 养 皿 上 注 明 菌 株 编 号、分 离 日 期 后，放 入 2 6 培 养 箱 内 黑 暗 培 养 3 d 5 d，观 察 菌 落 生 长 情 况，单 孢 菌 株 的 菌 落 形 态 为 圆 形。5.9 保 存将 经 鉴 定 得 到 的 稻 瘟 病 菌 单 孢 菌 株 移 至 酵 母 淀 粉 斜 面 培 养 基 上，培 养 7 d 1 0 d 后 备 用。