ICS 65.020.30 B 44 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 863 2019 水产微生 态制剂 解 淀粉芽胞 杆菌生产 技术规程 Aquatic probiotics-Technical regulation for production of Bacillus amyloliquefaciens 2019-01-14 发布 2019-02-15 实施 天 津 市 市 场 监 督 管 理 委 员 会 发布 DB12/T 863 2019 I 前 言 本标准 依据GB/T 1.1 2009 标 准化 工作 导则 第1 部 分：标 准的 结构 和编 写 的要求 起草。本标准 由天 津市 农业 科学 院 提出 并 归 口。本标准 起草 单位：天 津市 农业生 物技 术研 究中 心。本标准 主要 起草 人：谢凤 行、张 峰峰、周 可、赵琼、赵玉 洁、孙海 波、高宝 山。DB12/T 863 2019 1 水 产微生 态制剂 解 淀粉芽 胞杆菌生 产技术 规程 1 范围 本标准 规定 了 解 淀粉 芽胞 杆菌生 产中 所涉 及的 生产 环境和 设备、生 产技 术流 程、质 量检 测 和储运。本标准 适用 于 水 产微 生态 制剂解 淀粉 芽胞 杆菌 的生 产。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB 3095 环境 空气 质量 标 准 GB 3838 地表 水环 境质 量 标准 GB 20287 农用 微生 物菌 剂 GB/T 26428 饲 用微 生物 制剂中 枯草 芽孢 杆菌 的检 测 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 标准。3.1 解淀粉 芽胞 杆菌 bacillus amyloliquefaciens 属于芽 胞杆 菌科，芽 胞杆 菌属，杆状，有 鞭毛，革 兰 氏阳 性菌，芽 胞椭 圆形，中生 或近 中生。3.2 原菌种 the original strain 由单菌 落分 离纯 化，并在 固体斜 面上 繁殖 保存 的菌 种。3.3 一级菌 种 first class strain 原菌种 在培 养皿 上活 化，挑取单 菌落 接种 至三 角瓶 中，振 荡培 养的 菌种。3.4 二级菌 种 second class strain 三角瓶 中的 菌种 接种 至种 子罐中，在 种子 罐中 放大 培养的 菌种。4 生产环 境和 设备 要求 4.1 生产环 境 4.1.1 厂区空 气质 量符合 大 气环 境质量 标 准GB 3095 中 类 要求。4.1.2 发酵用 水符合 地 表水 环境 质量标 准GB 3838 中 类 水质要求，冷却 水及 其他 用水符合 该 标准 中类水 质要 求。4.1.3 生产车 间配 备消 毒灭 菌设 施，菌 种储 藏室 和无 菌操 作间与 生产 车间 分开。DB12/T 863 2019 2 4.2 生产设 备 生产设 备 需 为不 锈钢 发酵 罐，体 积根 据生 产规 模自 定。5 生产技 术流 程 5.1 生产流 程 生产 技 术流 程见 附录A 5.2 菌种质 量 5.2.1 用于发 酵的 菌种 应有 菌种 鉴定报 告或 菌株 来源 相关 信息。5.2.2 在发酵 前应 先检 测菌 种的 纯度和 性能，如 不纯 或退 化，应 先进 行提 纯复 壮。5.2.3 菌种在 上罐 生产 之前 需检 测种子 罐中 菌体 的纯 度和 浓度，不能 有杂 菌污 染，浓度达 到每 毫升 亿级以上。5.3 培养基 5.3.1 原菌种 和一 级菌 种的 培养 基 应保 证菌 种生 长的 延滞 期短，生长 旺盛，碳、氮 源营养 丰富。5.3.2 二级菌 种培 养基 原则 上为 发酵培 养基 或接 近发 酵培 养基。5.3.3 发酵培 养基 在保 证菌 体生 长旺盛，利 于芽 胞 形 成的 前提下，尽 量利 用来 源充 足、价 格低 廉的 原料。5.4 灭菌 5.4.1 液体发 酵，发酵 罐的 装液 量 50%70%，液 体培 养基、发酵 设备、管道、补料 罐等采 用高 压蒸 汽灭菌，灭菌 条件 为121 125，0.1 MPa 0.15 MPa，灭菌 20 min 30 min。5.4.2 固体物 料含 水 率 50%60%，121 130，灭菌1.0 h 2.0 h。5.4.3 灭菌后 无菌 操作 取灭 菌后 的培养 基，制片，染 色，镜检，无微 生物 说明 灭菌 彻底，若有，需 重复5.3 的工 作。5.5 接种 摇瓶种 子到 发酵 罐种 子接 种量 为1%5%，种 子罐 到 发酵罐 接种 量 为5%7%。接种保 证无 菌操 作，调节进、排气 阀，使接 种口 有气体 排出。5.6 发酵 5.6.1 芽胞杆 菌的 发酵 温度 为 25 37。5.6.2 液体发 酵在 发酵 过程 中通 入无菌 空气，通 气量 为 10 m3/ht20 m3/h t，搅 拌 转数 80 r/min 150 r/min。5.6.3 芽胞率达到 80%以上 终止 发酵。5.6.4 发酵周期 24 h 48 h。5.6.5 发酵过 程加 入 天 然油 脂类 或有机 硅类 消泡 剂，可采 用蠕动 泵添 加，也可 在配 置培养 基时 加入。5.7 发酵后 处理 发酵后 的液 体菌 剂直 接分 装，或 用 沸 石粉、凹 凸棒 土等 载 体吸 附，载体 的杂 菌率 1.0104 CFU/g，固体发 酵菌 剂直 接风 干。包装容 器应 灭菌 处理。DB12/T 863 2019 3 6 质量检 测 6.1 检测指 标 每个批 次的 产品 抽样 检测 包括感官、水分、有 效 活 菌数、芽胞 率、杂菌 率等 指标，检验 合格 方 可 出厂。6.2 感官检 测 6.2.1 取液体 菌剂 约250 mL（固 体菌剂 约 250 g）于 无色 玻 璃杯中，采 用目 测、鼻嗅 的方法 进行 检验。6.2.2 液体菌 剂为 淡黄 色或 棕黄 色，存 放过 程中 可能 出现 沉淀，具清 淡的 腥味；固 体菌剂 棕色 或浅 棕色，具 有 明 显的 发酵 气味。6.3 有效活 菌数、芽 胞 率 检测 6.3.1 样品稀 释 液体菌 剂用 灭菌0.85%的 生 理盐水 梯度 稀释，固 体菌 剂 稀释 方法 按照GB 26428 规定执 行。6.3.2 涂平板 有 效 活菌 测定 直接 用2 3个 梯 度稀 释液（10-6、10-7、10-8）在含 淀粉 的培 养基(参见 附录B)上涂 平板，每 个梯度 涂3个 平板，芽 胞数 则将2 3个 梯度稀 释液80 处理10 min后在 含淀粉 的培养 基(参见 附录B)上 涂平 板。6.3.3 培养 将涂好 的平 板在 室温 中放 置15 min，使接 种物 完全 被琼脂 吸收，倒 置于 培养 箱中37 培养48 h。6.3.4 计数 选取菌 落数在30300 个 之 间的平 板计数，典 型的解 淀粉芽 胞杆菌 菌落 表 面粗糙，不 透明，边缘 不规则，呈浅 米黄 色，消耗 培养基 中的 淀粉 在菌 落周 围产生 透明 圈。芽胞 数除 以菌数 即为 芽胞 率。6.4 杂菌率 的测 定（好氧 或兼 性厌氧 杂菌）从 用 来测 定有 效 活菌 数且已 经 过10 倍系 列 稀释 的样品 中，选取10-5、10-6、10-73 个 稀 释度 进行 杂菌率测定。平 板 计 数法，按GB 20287执行。6.5 固体菌 剂水 分含 量测 定 按GB 20287 执行。7 储运 7.1 应贮存 在通 风、干燥、清 洁的仓 库，仓库 内无 有害 气体、易燃 易爆 物品 及有 腐蚀性 的化 学物 品，远离热 源。7.2 长途运 输时，防 止日 晒、雨淋，避免 长期 受压 和机 械损伤。产 品不 应和 易燃、易爆、易 腐蚀 的物品同车（或 其他 运输 工具）装运。A DB12/T 863 2019 4 附 录 A（规范 性附 录）解淀粉 芽胞 杆菌 生产 技术 流程图 图A.1 解淀粉 芽胞 杆菌 生产 技术 流程图 原菌种 一级菌 种 二级菌 种 配置培 养基 接种 发酵 合格 灭菌 质量检 测 合格 不合格 按规定 处理 出厂 发酵物 检测 不合格 按规定 处理 发酵后 处理 纯度和 性能 检查 无菌空 气 DB12/T 863 2019 5 B B 附 录 B（资料 性附 录）计数用 培养 基 含淀粉 培养 基成 分（每升 培养基 含量）:可溶性 淀粉：10 g；蛋白胨：10 g；硫酸镁：0.5 g；磷酸氢 二钾：1 g；碳酸钙：1 g；琼脂：18 g；蒸馏水：1000 mL；pH:7.0-7.5；灭菌条 件：121 灭 菌20 min。_