ICS 11.220 B 41 DB51 四川省地方标准 DB 51/T 26872020 羊包虫病防治技术规范 2020-07-14发布 2020-08-01实施四川省市场监督管理局 发布 DB51/T 26872020 I 目 次 前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 诊断.15 疫情报告.26 疫情处置.27 预防控制.38 人员防护.5附录 A（规范性附录）免疫层析法.6附录 B（规范性附录）酶联免疫吸附试验（ELISA）.7附录 C（规范性附录）分子生物学检测方法.8 DB51/T 26872020 前 言 本规范依据GB/T 1.1-2009的规定起草。本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录。本标准由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本标准由四川省市场监督管理局批准。本标准起草单位：四川省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：周明忠、阳爱国、袁东波、郭莉、侯巍、尹杰、莫茜、伊力军、郭万里、曾子鑫、李春、蔡冬冬、刘瑞瑛、张辉、王正义。DB51/T 26872020 1 羊包虫病防治技术规范 1 范围 本规范规定了羊包虫病的诊断、疫情报告、疫情处置、预防控制和人员防护。本规范适用于四川省行政区域内从事羊养殖、运输、屠宰、加工、交易及羊包虫病防治活动有关的单位和个人。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 32948 犬科动物感染细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验检测技术 DB51/T 1105 动物棘球蚴病（包虫病）防治技术规范 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 中华人民共和国动物防疫法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 羊包虫病 由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）幼虫寄生于绵羊、山羊等的肝、肺等器官所引起的一种人畜共患寄生虫病。4 诊断 4.1 流行特点 4.1.1 易感动物 绵羊、山羊等草食动物。其中绵羊最为易感，山羊、牛、猪次之。传染源和传播途径 感染细粒棘球绦虫的犬是囊型包虫病的主要传染源，寄生于犬小肠内的成熟虫体、孕卵节片或者虫卵随粪便排出体外，羊因摄入被成虫、孕卵节片或者虫卵污染的饲草、饮水等，经消化道或呼吸道等途径感染包虫病。4.1.2 流行区域 该病主要分布在牧区和半农半牧区。我省主要流行区为川西高原藏区，其他地区为散发流行。4.2 临床症状 DB51/T 26872020 该病感染早期无明显症状，感染后期严重时，病羊表现被毛逆立、脱毛，发育不良、消瘦，发生咳嗽，咳后长久卧地不起，个别羊可因包囊破裂产生过敏性休克而突然死亡。当包囊大量生长于肝脏时，叩诊时浊音区扩大，腹部右侧膨大，触诊时病羊表现疼痛。4.3 病理变化 肝、肺等脏器可见大小不等的囊状突起，也可在脾、肾、肌肉、皮下等多处发现包囊。包囊周围有类上皮细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞浸润及纤维母细胞增生，最终可形成纤维性包膜(外囊),外囊厚度一般为35mm，包囊内充满液体，液体沉淀后用肉眼或在解剖镜下可见许多生发囊与原头蚴。由于包虫的不断生长，压迫周围组织、器官，引起组织细胞萎缩、坏死。4.4 实验室诊断 4.4.1 镜检观察 将采集的疑似包囊病灶样品,以4%福尔马林盐水固定,采用常规组织学技术染色检测。显微镜下观察，结缔组织下出现过碘酸雪夫氏(PAS)阳性无细胞结构的角质层,内层为具有细胞核结构的生发膜,即可视为棘球蚴的特征性结构。可育囊内或棘球砂中出现原头蚴也是包虫病病原的诊断特征。4.4.2 血清学检测 采用免疫层析法、ELISA法检测羊血清中特异性抗体水平。免疫层析法操作程序见附录A。ELISA法具体操作程序见附录B。4.4.3 分子生物学检测 采用分子生物学方法检测包虫核酸，具体操作程序见附录C。4.5 结果判定 符合4.1、4.2和4.4.1的结果为阳性判定为疑似；符合4.1、4.2和4.4.2的结果为阳性判定为疑似；符合4.3和4.4.3的结果为阳性判定为患病动物；符合4.4.2和4.4.3的结果为阳性判定为患病动物。5 疫情报告 任何单位和个人发现疑似病例后,应当及时向当地动物疫病预防控制机构报告。动物疫病预防控制机构接到疫情报告并确认后,按有关规定及时逐级上报，并及时向同级兽医行政主管部门报告。应准确报告疫情发生的时间、地点，感染动物种类、数量、病理变化、诊断情况，流行病学和疫源追踪情况，已采取的控制措施，疫情报告单位、负责人、报告人及联系方式等。6 疫情处置 6.1 疫情确认 羊包虫病疫情由县级以上兽医主管部门根据疫病流行特点、临床症状、病理变化和实验室检测结果予以确认。DB51/T 26872020 3 6.2 疫点、疫区、受威胁区的划分和处置措施 6.2.1 疫点 为发病羊所在的地点。相对独立的规模化养殖场（户），以病羊所在的养殖场（户）为疫点；散养羊以病羊所在的自然村为疫点；放牧羊以病羊所在的牧场及其活动场地为疫点。6.2.2 疫区 疫点内犬只经常活动的区域，以县级以上动物疫病预防控制机构根据实际调查结果划定。6.2.3 受威胁区 疫点内犬只活动的最大区域，以县级以上动物疫病预防控制机构根据实际调查结果划定。6.2.4 病羊、污染物品及环境的处理 对病羊立即隔离，限制移动。对病变脏器采用高温、焚烧或化制等方式进行无害化处理。对羊舍、活动场地、器具、垫料、饲草和粪便等应用10%的氢氧化钠溶液喷洒或火焰消毒处理。6.2.5 感染犬只、污染物品及环境的处理 按7.1.1定期对犬只进行驱虫。对犬舍、活动场地、器具、垫料、饲料和粪便等应用10%的氢氧化钠溶液喷洒或火焰消毒处理。7 预防控制 7.1 犬只的防治 7.1.1 犬只驱虫 按犬只每公斤体重510mg的剂量一次性口服吡喹酮，每46周驱虫一次，一年812次。投药前家犬应禁食1天，然后将药片夹在食物中（如馒头、肉等，或用含诱食剂的吡喹酮）进行投喂，确认犬吞服后进行犬只驱虫登记。7.1.2 犬只驱虫后粪便的处理 收集犬只驱虫后5天内的粪便，采用深埋、焚烧或10%的氢氧化钠溶液消毒等方式进行无害化处理，防止虫卵污染环境。7.1.3 严格犬只数量管理 犬只管理机构应加强犬只的管理和登记，实行拴养、圈养制度，应及时扑灭阳性犬，严格管控犬只数量。7.2 免疫 7.2.1 疫苗选择 采用羊包虫病疫苗（含细粒棘球蚴Eg95抗原）进行羊免疫。7.2.2 疫苗的保存、运输 DB51/T 26872020 在28下保存，避免高温和阳光直射，忌剧烈摇荡。疫苗稀释后，如不能当日用完，可在-20冻存，但只能冻融1次，不可反复冻融使用。7.2.3 免疫程序 免疫程序的制定应以羊群包虫病血清抗体水平的高低为依据。免疫过的母羊所产羔羊应在16周龄进行首次免疫，20周龄进行强化免疫。未免疫过的母羊所产羔羊应在8周龄进行首次免疫，12周龄进行强化免疫。免疫过的羊每12个月加强免疫1次。7.2.4 免疫要求 接种的羊必须临床表现健康，疫苗注射当天早晨应禁饲。疫苗使用前要逐瓶检查，药瓶应无破损、真空包装完整，瓶签上疫苗的名称、批号、有效日期、检验号码等必须清楚。包装破损、破乳分层、颜色改变等现象的疫苗不得使用。疫苗使用前应置于室温（2225）2小时，使用时充分摇匀，保持匀质。疫苗启封后，24小时内用完。按瓶签注明的头份，用灭菌生理盐水稀释，每只羊颈部皮下注射1mL。7.2.5 免疫质量控制 安排专人负责监督接种过程，发现漏种的羊要及时补种，对免疫血清抗体水平不合格的羊要及时强化免疫。做好免疫记录工作。记录内容包括：羊的品种、年龄、疫苗的来源、批次、接种时间等。7.2.6 免疫效力的评价 羊群在同批次疫苗接种前和免疫后3周，分别静脉采血3-5mL分离血清，检测羊的免疫抗体水平，评价免疫效果。7.2.7 不良反应处置 及时在羊皮下注射0.1%盐酸肾上腺素1mL，视病情缓解程度，20分钟后重复注射相同剂量1次；肌肉注射盐酸异丙嗪100mg，地塞米松磷酸钠10mg（孕羊不得使用）。7.3 检疫 按家畜棘球蚴病有关检疫规定进行检疫和处置。7.4 监测 7.4.1 监测对象 绵羊、山羊等中间宿主。犬只等终末宿主。7.4.2 监测方法 对羊群按4.3观察病理变化，结合4.4.1病原学检测和4.4.2血清学检测方法进行监测。对犬等终末宿主按照国家规定的检测方法进行监测。初次监测应进行流行病学调查。7.4.3 监测范围、时间及数量 DB51/T 26872020 5 对羊群每年进行一次血清学监测，每县（市）在不同乡应抽检300头（只）以上，年龄应在12月龄以上。犬只等终末宿主每年至少进行一次粪样监测，监测数量每县应在100只以上。7.4.4 监测结果处理 及时向当地动物疫病预防控制机构报告监测结果。判断为患病动物时，按6.1、6.2和7.5进行处置，以及按7.1、7.2和7.3进行预防和控制。7.5 屠宰管理 按有关规定对羊进行屠宰检疫和产品检验。不得出售病变脏器，以及将病变脏器喂犬。不得在屠宰场内养犬，并防止犬只进入屠宰场。对病变脏器应进行高温高压、焚烧或深埋等无害化处理。8 人员防护 应穿防护服、长筒靴子，戴手套、口罩和护目镜等开展包虫病相关防控工作。使用过的防护服、口罩和一次性手套采用高温或焚烧等方式进行无害化处理，护目镜、靴子用10%次氯酸钠溶液消毒或者高温进行杀虫灭卵。在防控过程中，应对犬只粪便、羊包囊及污染物采用深埋、高温或焚烧等方式进行无害化处理。DB51/T 26872020 A A 附 录 A（规范性附录）免疫层析法 A.1 材料准备 A.1.1 抗原 采用包虫纯化抗原。A.1.2 待检血清/全血 适用于检测羊的血清及全血样品。样品须新鲜、无污染及未变质。若样品有大量血脂，应处理后去澄清部分检测。全血样品：采用抗凝剂处理的全血，应在24小时内检测，避免冷冻及溶血。A.2 操作方法 A.2.1 用滴管吸取血清或全血，垂直、缓慢、逐滴地准确将2滴样品滴入装有样品稀释液的滴瓶内。A.2.2 盖上瓶盖，摇晃混匀。A.2.3 将检测卡平衡至室温后从铝箔袋中取出，放置在平整表面。A.2.4 用滴瓶缓慢、逐滴准确地滴加3滴稀释后的样品到检测卡的加样孔中。A.2.5 室温下（1825）放置10分钟内判断结果，超过10分钟结果无效。如果环境温度过低或过高，可能影响反应，应调节温度后检测。A.3 结果判断 阳性：检测（T）线区及对照（C）线区同时出现红色线。阴性：只有对照（C）线区出现一条红色线。无效：对照（C）线区不出现红色线。DB51/T 26872020 7 B B 附 录 B（规范性附录）酶联免疫吸附试验（ELISA）B.1 材料准备 B.1.1 抗原 包虫囊液纯化抗原（磷钨酸、氯化镁沉淀法制备）。B.1.2 待检血清 无菌采集羊血，分离血清。B.2 操作方法 B.2.1 抗原包被聚苯乙烯板：用005mo1/L pH9.6碳酸缓冲液稀释抗原至最适浓度，每凹孔加入100uL，置温盒。4 过夜（或1224h），次日，倾去抗原，用含005吐温20磷酸缓冲盐水（001molL，pH7.4PBST）洗涤3次，每次5min，甩干。B.2.2 加待检血清：血清用PBST作12 0 0 稀释，每凹孔加入100 L，每板应设参考阳性一孔，参考阴性三孔及PBS对照一孔。置温盒，37 1h，然后取出，倾去血清，洗涤同前。B.2.3 加结合物：加入用PBST作工作稀释度的辣根过氧化物酶（HRP）标记结合物100L，37，1h倾去结合物，洗涤同前。B.2.4 加底物：通常加邻苯二胺（OPD）底物溶液（10mg OPD25mL pH50柠檬酸缓冲液30H(下标始)2(下标终)O(下标始)2(下标终)10 L）100L，37，30min。B.2.5 加中止液：2molLH(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终)50 L。B.3 结果判断 在酶标专用比色计上读取492nm OD值，以待测样本（S）对阴性对照血清（N）的SN值21为阳性临界值。DB51/T 26872020 C C 附 录 C（规范性附录）分子生物学检测方法 C.1 样本处理 剖开疑似包囊，取包囊内膜10-30mg，提取DNA。C.2 普通PCR C.2.1 引物 F1：5-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3 R1：5-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3 C.2.2 扩增体系 反应采用25 L体系：2EasyTaq PCR SuperMix12.5 L、上下游引物各1 L（10 M）、DNA模板1 L、ddH2O 9.5 L。C.2.3 扩增程序 94预变性5 min；然后40个循环：9415S，5035S，7235S；最后72延伸8 min，产物大小420bp。C.2.4 结果判定 取2 LPCR扩增产物（包括阴阳性对照）及4 LDNA标准Maker对照，于1.5琼脂糖（含Gelstain核酸染料）凝胶中80V电泳30min，而后于凝胶成像仪中观察结果，有目的条带即为阳性。若需要进一步确认检测结果，可直接取10uL PCR阳性产物进行测序；C.3 荧光PCR(探针法)C.3.1 引物 F:TGTACTGGTTGGGGTGGTTACAA R:GCCTCAAACCTAACAGATCCAAAA（MGB）探针：CACATCGAACAGACCTT C.3.2 扩增体系 每个样本反应体系为20uL，上下游引物终浓度：0.9 uM,探针终浓度：0.25uM。其中，模板1-2 L（阴性对照模板为2 L无菌双蒸水），上下游引物各1.8 L，探针0.5 L，PCR 反应液10 L,其余用无菌双蒸水补齐。C.3.3 扩增程序 9430s；DB51/T 26872020 9 9410s，6040s(采集荧光)；40-45cycles.C.3.4 结果判定 C.3.4.1 质控样品：阴性样品无Ct值或无扩增曲线；阳性样品Ct值应小于25，并出现典型扩增曲线；否则，此次试验视为无效。C.3.4.2 结果判断：阴性样品无Ct值或无扩增曲线；阳性样品有Ct值且出现S型扩增曲线，表示样品中有包虫DNA。_