ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3256 2020 非洲猪瘟 病毒等温 扩增快速 检测方法 Loop-mediated Isothermal Amplification（LAMP）for Rapid Detection for African Swine Fever Virus 2020-04-30 发布 2020-05-30 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB21/XXXXX XXXX I 前 言 本标准 按 照GB/T 1.1 2009 给 出的 规则 起草。本 标准 由辽 宁省 农业 农村厅 提出 并归 口管 理。本标准 起草 单位：辽宁 省 农业发 展服 务中 心、中 国 科学院 微生 物研 究所、洛 阳莱普 生信 息科 技有 限公司、辽宁 佰瑞 生物 科技 有限公 司。本标准 主要 起草 人：杨作 丰、周 晨阳、李 秀梅、王 宏燕、杨利 敏、董娜、刘 文军、张皓 淳、姚 伟、刘洋、刘近、吴 洪涛、任 雪建、赵培、李 蓉、章春 燕、吕 园园、陈腾。本标准 发布 实施 后，任何 单 位和个 人如 有问 题和 意见 建议，均可 以通 过来 电和 来 函等方 式进 行反 馈，我们将 及时 答复 并认 真处 理，根 据实 际情 况依 法进 行评估 及复 审。归口管 理部 门通 讯地 址：辽 宁省农 业农 村厅（沈 阳市 和 平区太 原北 街2 号），联 系电 话：024-23447862；标准起 草单位 通讯 地址：辽宁省 动物及 产品 检疫中 心（沈 阳市沈 河区 万柳塘 路105号 甲），联 系 电话：024-24229579。DB21/T 3256 2020 1 非 洲猪瘟 病毒等温 扩增快 速检测方 法 1 范围 本标准 规定 了非 洲猪 瘟病 毒等温 扩增 快速 检测 方法 的技术 要求。本标准 适用 于非 洲猪 瘟疫 病的诊 断、监测 及流 行病 学调 查，适 用于 猪血 液、脾脏、淋巴 结、肾 脏 等组织样 品中 非洲 猪瘟 病毒 核酸的 快速 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB 19489 实 验室 生 物 安全通 用要 求 3 原理 非洲猪 瘟病毒 是一 种DNA 病 毒，该 检测方 法利 用6条 特 异性引 物和具 有链 置换能 力的DNA 聚合 酶，在等温环 境下1 h 内完 成扩 增，用于 非洲 猪瘟 病毒 的核 酸检测。4 仪器和 器材 4.1 高 速台 式冷 冻离 心机（离心 范 围020000 r/min）4.2 冰 箱：4 1 冰 箱，-20 1 冰箱，-7 1 冰 箱 4.3 恒温 LAMP 扩增 仪（型 号：Gene-8C）4.4 离 心管：15 ml 离心 管、1.5 ml 离 心管 和0.2 ml PCR 专 用离 心管 4.5 微 量移 液器：1000 l，200 l，100 l，50 l，20 l，10 l，2 l 5 试剂和 引物 5.1 样 品处 理剂 5.2 ASFV-R-Mix 5.3 Bst enzyme 5.4 D-I 矿 物油 5.5 阳 性对 照 5.6 阴 性对 照 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA 或DNase 的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。DB21/T 3256 2020 2 6 操作步骤 6.1 样品的 采集、前 处理、存 放与运 输 6.1.1 采样 注意 事项 采集样 品及 样品 前处 理过 程中应 戴一 次性 手套，样 本间不 得交 叉污 染。6.1.2 采样 工具 15 ml 离 心管 和1.5 ml 离 心 管经121 1 高压 灭菌20 min；剪刀、镊子 经160 干热 灭菌2 h，无菌管（真空 采血 管）。6.1.3 组织 病料 的采 集与 前处理 采集疑 似非 洲猪 瘟病 毒感 染猪的 肺脏、肝 脏、肾脏、脾脏等 组织 样品，用 无菌 的剪刀 和镊 子剪 取 待检样品 约10 g 于 组织 匀浆 器或研 钵中 充分 匀浆 或研 磨，加 入0.3 ml 0.5 ml 组 织悬液 混匀，60，30 min灭活后，将 悬液 转入 无菌Eppendorf 管 中，4 条件 下5000 r/min离心10 min，编号 备用。6.1.4 全血 及血 清样 本的 采集与 前处 理 使用含 有抗 凝血 剂（EDTA-紫色盖）的无 菌管（真空 采血管）从耳 静脉 或前 腔 静脉采 集血 液3 ml 5 ml，60，30 min 灭活 后，可直 接检测；若 检测血 清，可 静置全 血样 本待血 清析出 后，直 接吸 取至 无菌Eppendorf 管 中，60，30 min 灭 活后，编 号备 用。6.1.5 存放 与运 输 采集或 处理的 样品 在28 条件 下保存 应不 超过24 h；若需 长期 保存，应放 置-70 冰箱，但应避免反 复冻 融（冻融 不超 过3次）。采集 的样 品密 封 后，采 用保 温壶 或保 温桶 加冰密 封，在8 h 之内 运送到实验 室检 测。按照 兽 医实验 室生 物安 全技 术管 理规范 进 行样 品的 生物 安全标 识。6.2 样品DNA 的 提取 取10 l前 处理 过的 样本 加入无 菌1.5 ml 离心 管，加 入10 l样 品处 理剂，混 匀，94 裂 解2 min，瞬时离 心，上清 即为 扩增 模板。6.3 核酸扩 增 6.3.1 吸取22 l ASFV-R-Mix 和1 l Bst enzyme 加入 同一 个PCR 管，吸 取 2 l 步骤6.2 处理 的核酸扩 增模 板加 至PCR 管，混匀，设 置阴 阳性 对照；6.3.2 吸取10 l D-I 矿 物油 轻 轻加 至PCR 管液 面，切勿 震荡混 匀；6.3.3 插入到 恒温 扩增 仪反 应槽 中；6.3.4 设置恒 温扩 增仪 器反 应条 件为：65 反 应 12 min，荧光 采集 周 期20 s。7 试验成 立条 件与 结果 判定 7.1 试验成 立条 件 使用前 用阴、阳 性对 照进 行该检 测方 法评 价，若阳 性对照CT值40，阴 性对 照CT值40，则 检 测 结果有效。DB21/T 3256 2020 3 7.2 结果判 定 若CT值40，样品 应判 定 为非洲 猪瘟 病毒 核酸 阳性；若CT值40，样品 应判 定 为非洲 猪瘟 病毒 核酸阴性 8 实验室 生物 安全 要求 按照GB19489 实 验室 生物 安全 通 用要 求执 行。DB21/T 3256 2020 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂配 制 A.1 样品 处理 剂的 制备 量取80 ml PBS（0.01 mol/L，pH 值7.4），加 入10 l NP40（乙 基苯 基聚乙 二醇），无菌 纯化 水定容至100 ml，定量 分装，500 l/管，-20 保 存。A.2 ASFV-R-Mix 的 制备 A.2.1 引 物合 成 根据非 洲猪 瘟病 毒p72 基 因 片段的 保守 结构 域设 计3 对 引物，包括1对 内引 物（FIP 与BIP）、1对 外引物（F3 与B3）和1对 环引 物（LF与LB），均 由上 海生 工生物 工程 股份 有限 公司 合成，序列 为：FIP：5-TAACGCCACTATGCAGCCCACGGAAGAGCTGAATCTCTATCCT-3 BIP：5-CAACATGTGCGAACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC-3 F3：5-ATAGGTAATGCGATCGGATACA-3 B3：5-CCAACAATAACCGCCACGC-3 LF：5-TCGCCACGCAAAGATAAGC-3 LB：5-AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT-3 A.2.2 引 物混 合物 的制备 取3对引 物（FIP、BIP、F3、B3、LF 和LB）干 粉，按 引物说 明书分 别加 入适量 无菌纯 化水，溶解 混匀，得 到各 引物 溶液，置-20 保存。A.2.3 ASFV-R-Mix 的配 制 称取2.4 g Tris，0.37 g 氯化钾，0.12 g 硫酸镁，100 l 吐温-20，7.029 g甜菜碱，溶于80 ml纯化水，依次 加入 终浓 度 为1.4 mmol/L dNTPs 溶液、0.2 mol/L 外 引物 溶液、1.6 mol/L 内 引物 溶液、0.8 mol/L 环引 物溶液，加入无 菌纯化 水定 容至100 ml，经 过0.22 m 滤器 过 滤除菌，分装 至2 ml 蓝盖可立 冻存 管中，1.1 ml/管，-20 保存。A.3 Bst enzyme 的 制备 用于 制备本试剂盒 的Bst enzyme 为商品化DNA 聚合 酶，按 使用说明书用 纯化水稀释 至4106/L，分装至0.5ml 白盖 可立 冻存 管中，100/l 管，-20 保存。A.4 D-I矿 物油 用于制备本试剂盒的D-I矿物油为商品化矿物油，分装至2 ml 黄 盖 可 立 冻 存 管 中，500 l/管，-20 保存。A.5 阳性 对照 采用核 酸蛋 白质 分析 仪测 定阳性 质控 品浓 度，计算 质粒拷 贝数，用 纯化 水将 其稀释 为103拷贝/l，分装至0.5 ml 红 盖可 立冻 存管中，100 l/管，-20 保 存。A.6 阴性 对照 取纯化 水，分装 至0.5 ml 绿盖可 立冻 存管 中，100 l/管，-20 保存。DB21/T 3256 2020 5 _